enChIPによる遺伝子座特異的ヒストン修飾酵素複合体とエネルギー代謝機構の解明

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26560395
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 酒井 寿郎 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (80323020)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 生活習慣病 / エピゲノム / ヒストン修飾酵素

研究実績の概要

1-1． レトロウィルスベクターを用いたenChIP用CRISPR系の作製。ガイドRNAをデザインし、目的とする遺伝子座にdCAS9をターゲットさせる仕組の構築に成功した。未分化褐色脂肪細胞を用い、目的とする遺伝子座領域にガイドRNAを作製し、これらのウィルスベクターを発現させ、クロスリンクの後Flagタグでクロマチン免疫沈降 (ChIP) を行い、十分にこの領域のDNA濃縮が得られることを確認した。1-2. enChIP-Seq 法によるUcp1, Adrb1 遺伝子プロモーターと相互作用しているゲノム領域の網羅的同定。Ucp1やAdrb1は成熟褐色脂肪細胞に分化して十分量が発現してくる遺伝子である。そこで成熟脂肪細胞でenChIPを行うために、予備検討を行った。良好な濃縮が未分化前駆褐色脂肪細胞では得られたものの、脂質の蓄積した脂肪細胞に分化させると、タンパク質複合体解析や次世代シーケンサー解析に耐えうる十分な濃縮が得られなかった。1-3. enChIP-MS 法を用いたゲノム間相互作用を媒介する分子の同定。上述したとおり、脂肪滴を蓄積した脂肪細胞では現在十分な濃縮が得られず検討中である。

2． S265A 変異-JMJD1A ノックインマウスの作製： PKA によりリン酸化されるセリンをアラニンに変異させたマウスJMJD1a のコンストラクトの作製を進めノックインマウスを樹立した。現在順調に繁殖しており、寒冷刺激での低体温、肥満が起こるかなどの実験を予定している。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

平成26年には成熟褐色脂肪細胞でのenChIPを樹立する予定であったが、脂肪をため込まない前駆脂肪細胞でのみ系が確立している。一方ノックインマウス作製の計画はジェノタイピングから、予定通り進んでいる。

今後の研究の推進方策

成熟脂肪細胞でのChIP効率が悪いのは、取り除けきれない脂肪が邪魔をしているのかも知れないが、使用しているプロモーターがLTRというウィルス由来の弱いプロモーターを使っていることも懸念される。よって、レンチウィルスを用いて、EF1などより強いプロモーターでドライブされるベクターを構築する。
一方で、分化させない前駆脂肪細胞ではFlagタグで目的とする遺伝視座にターゲットさせることは可能となった。前駆脂肪細胞において、脂肪細胞のマスターレギュレーター遺伝子上でDNA切断活性のないdCAS9を発現させ、enChIP-seq, enChIP-MSを樹立することが現実的によりハードルが低いのでこれを優先して行う。
さらに、DNA切断活性をもつ3xFLAG-Cas9-NLSを一過性に発現させ、すでに明らかにしてきたUcp1遺伝子の遠隔にある活性化領域を欠失させる細胞株を構築し、proof of concept を行う。実際にAdrb1の44kb上流のエンハンサー領域の遺伝子を2対欠失させることに成功した。Βアドレナリン刺激でより遺伝子発現上昇の見られるUcp1遺伝子13kb上流に新規に同定した活性のあるエンハンサー領域を欠失させるためにトランスフェクションをおこない、2対の遺伝子の双方ともにこの領域が欠失している細胞をFacsでGFPをマーカーにソーティングした後、2対の遺伝子も目的の場所で欠失された細胞を選択中である。

研究成果

• [雑誌論文] The FBXL10/KDM2B Scaffolding Protein Associates with Novel Polycomb Repressive Complex-1 to Regulate Adipogenesis (2015)
  • 著者名/発表者名: Inagaki T, Iwasaki S, Matsumura Y, Kawamura T, Tanaka T, Abe Y, Yamasaki A, Tsurutani Y, Yoshida A, Chikaoka Y, Nakamura K, Magoori K, Nakaki R, Osborne TF, Fukami K, Aburatani H, Kodama T, Sakai J.
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 290 ページ: 4163-4177
  • DOI: http://www.jbc.org/content/290/7/4163.full.pdf+html
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] PPARβ/δactivation of CD300a controls intestinal immunity. (2014)
  • 著者名/発表者名: Tanaka T, Tahara-Hanaoka, Mabekura T, Ikeda K, Jiang S, Tsutsumi S, Inagaki T, Magoori T, Higurashi H, Takahashi H, Tachibana K, Tsurutani Y, Raza S, Anai M , Minami T, Wada Y, Yokote K, Doi T, Hamakubo T, Auwerx J, Gonzalez J, Nakajima A, Aburatani H, Naito H, Shibuya A, Kodama T, Sakai J.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 4 ページ: 4
  • DOI: http://www.nature.com/srep/2014/140624/srep05412/full/srep05412.html
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Direct Evidence for Pitavastatin Induced Chromatin Structure Change in the KLF4 Gene in Endothelial Cells. (2014)
  • 著者名/発表者名: Maejima T, Tanaka; T, Minami T, Hamakubo T, Ihara S, Sakai J, Nozaki N, Aburatani H, Ruan X, Tanabe H, Ruan Y, Endo A, Kodama T, Wada Y.
  • 雑誌名: PlOS One 巻: 9 ページ: e96005
  • DOI: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0096005
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Lineage-specific gene-body DNA methylation recruits SETDB1 to form non-canonical bivalent chromatin domains that inhibit Cebpa and Pparg expressions and adipogenesis (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshihiro Matsumura, Ayano Yoshida, Ryo Nakaki, Ken-ichi Wakabayashi, Takeshi Inagaki, Kiyoko Fukami, Hiroyuki Aburatani, Juro Saka
  • 学会等名: DEUEL Conference on Lipids
  • 発表場所: Monterey, California, USA
  • 年月日: 2015-03-04
• [学会発表] PKA dependent phospho-switch on JMJD1A regulates higher-order chromatin dynamics via SWI/SNF association for thermogenesis (2015)
  • 著者名/発表者名: Yohei Abe, Royhan Rozqie, Yoshihiro Matsumura, Takeshi Kawamura, Ryo Nakaki, Yuya Tsurutani, Kyoko Tanimura-Inagaki, Akira Shiono, Kenta Magoori, Kanako Nakamura, Shingo Kajimura, Hiroshi Kimura, Toshiya Tanaka, Kiyoko Fukami, Timothy F. Osborne, Tatsuhiko Kodama, Hiroyuki Aburatani, Takeshi Inagaki, Juro Sakai
  • 学会等名: DEUEL Conference on Lipids
  • 発表場所: Monterey, California, USA
  • 年月日: 2015-03-04
• [学会発表] FBXL10/KDM2B Regulates 3T3-L1 Adipogenesis via PRC1-dependent Transcriptional Repression. (2015)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Inagaki, Satoshi Iwasaki, Yoshihiro Matsumura, Yohei Abe, Timothy F. Osborne, Hiroyuki Aburatani, and Juro Sakai
  • 学会等名: DEUEL Conference on lipids
  • 発表場所: Monterey, CA, USA
  • 年月日: 2015-03-04
• [学会発表] PKA-dependent Association of Histone Demethylase JMJD1A with SWI/SNF and PPARγ Alters Chromatin Dynamics and Thermogenesis in Brown Adipocytes (2014)
  • 著者名/発表者名: Juro Sakai
  • 学会等名: The 37th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan
  • 発表場所: Pacifico Yokohama, Yokohama
  • 年月日: 2014-11-26
  • 招待講演
• [学会発表] Role of Isocitrate Dehydrogenase 3 in Regulation of Epigenome and Transcription during Adipogenesis (2014)
  • 著者名/発表者名: Ariyanto, E.F., Matsumura, Y., Soga, T., Inagaki, T., Sakai, J.
  • 学会等名: The 37th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan
  • 発表場所: Pacifico Yokohama, Yokohama
  • 年月日: 2014-11-26
• [学会発表] SETDB1は新規のクロマチンドメインを形成することでCebpαの転写と脂肪細胞分化を制御する (2014)
  • 著者名/発表者名: 松村欣宏，吉田文乃，仲木竜，鹿野優佳，若林賢一，稲垣毅，深見希代子，油谷浩幸，酒井寿郎
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜、横浜市
  • 年月日: 2014-11-26
• [学会発表] ヒストンメチル化酵素SETDB1のユビキチン化修飾 (2014)
  • 著者名/発表者名: 鹿野優佳，松村欣宏，吉田文乃，稲垣毅，酒井寿郎
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜、横浜市
  • 年月日: 2014-11-26
• [学会発表] JMJD1A のリン酸化スイッチは SWI/SNF および PPARg と複合体を形成しクロマチンの高次構造を変化させる (2014)
  • 著者名/発表者名: 阿部 陽平、Royhan Rozqie、松村 欣宏、川村 猛、仲木 竜、鶴谷 悠也、稲垣 (谷村) 恭子、塩野 陽、馬郡 健太、田中 十志也、児玉 龍彦、油谷 浩幸、稲垣 毅、酒井 寿郎
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜、横浜市
  • 年月日: 2014-11-26
• [学会発表] Chromatin Regulation via SWI/SNF and PPARγ Association in Brown Adipocytes (2014)
  • 著者名/発表者名: Juro Sakai
  • 学会等名: The 87th Annual Meeting of the Japanese Biochemical Society
  • 発表場所: Kyoto International Conference Center, Kyoto
  • 年月日: 2014-10-18
  • 招待講演
• [学会発表] Metabolic and environmental regulations of JmjC histone demethylases. (2014)
  • 著者名/発表者名: Juro Sakai
  • 学会等名: The 14th Annual Meeting of the Protein Science Society of Japan
  • 発表場所: Workpia Yokohama, Yokohama
  • 年月日: 2014-06-27
  • 招待講演
• [学会発表] 交感神経刺激による脂肪燃焼と肥満におけるエピゲノム変化の役割 (2014)
  • 著者名/発表者名: 酒井寿郎
  • 学会等名: 第87回日本内分泌学会学術総会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡県福岡市）
  • 年月日: 2014-04-24
  • 招待講演
• [学会発表] PKA-dependent phosphorylation of JMJD1A drives energy expenditure through Higher-Order Chromatin Regulation via SWI/SNF and PPARγ Association in Brown Adipocytes (2014)
  • 著者名/発表者名: Juro Sakai
  • 学会等名: The 18th International Vascular Biology Meeting
  • 発表場所: Miyakomesse, Kyoto
  • 年月日: 2014-04-15
  • 招待講演
• [学会発表] Metabolic and environmental regulations of JmjC histone demethylases. (2014)
  • 著者名/発表者名: Juro Sakai
  • 学会等名: The 18th International Vascular Biology Meeting
  • 発表場所: Miyakomesse, Kyoto
  • 年月日: 2014-04-14
• [図書] エピジェネティクスの産業応用 (2014)
  • 著者名/発表者名: 酒井寿郎
  • 総ページ数: 12
  • 出版者: シーエムシー出版
• [備考] 東京大学先端科学技術研究センター酒井研究室/原著論文
  • URL: http://www.mm.rcast.u-tokyo.ac.jp/publications/pubs.html