2014 年度実施状況報告書

天然RNAライブラリを基盤とした新規機能性RNAおよび新規機能性ペプチドの探索

研究課題

研究課題/領域番号	26560429
研究機関	東京大学
研究代表者	加藤敬行東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (90567760)
研究期間 (年度)	2014-04-01 – 2017-03-31
キーワード	機能性RNA / 機能性ペプチド / in vitroセレクション / アゴニスト
研究実績の概要	本研究では、生体内標的分子に特異的に結合する新規機能性RNA および新規機能性ペプチドの探索を行うための新しいin vitro セレクション法の開発を実施している。SELEX法やmRNAディスプレイ法などの既存のin vitroセレクション法ではランダムRNAライブラリやランダムペプチドライブラリを用いて標的に結合する分子の探索を行うが、本手法では生体から抽出したRNA（＝天然RNA）やそれを翻訳したペプチドをライブラリ化したものを用いることにより天然由来の機能性RNA や機能性ペプチドの探索を可能にするものである。現在までに、まずヒト培養細胞から抽出したsmall RNA画分を数十から数百塩基程度の長さに限定分解してRNAライブラリの構築を行い、これを用いて葉酸を標的としたin vitroセレクションの実施をした。また、RNAライブラリの5'末端側にSD配列と開始コドンを、3'末端側に終止コドンをそれぞれ付加することでペプチド翻訳用のRNAライブラリの構築を行った。さらにこの翻訳用RNAライブラリをpuromycinリンカーと連結したのちin vitro翻訳系を用いて翻訳することでペプチドライブラリを作成することに成功した。そしてこれを用いてin vitroセレクションが可能かどうかを検証するために、既知のペプチドリガンドが知られているタンパク質標的を用いたin vitroセレクションを開始した状況である。これにより、in vitroセレクションがうまく機能することが確認できれば、今後リガンド未知のタンパク質標的（オーファンGPCRなど）を用いたin vitroセレクションを開始する。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 1: 当初の計画以上に進展している理由当初の計画では、平成２６年度までにRNAセレクション用ライブラリを用いて葉酸を標的とするin vitroセレクションを実施する予定であった。実際にRNAライブラリの構築と葉酸を標的とするin vitroセレクションの実施は既に達成しており、セレクションの結果葉酸に結合するとみられるsmall RNAの配列を複数種類見出すことに成功した。現在、得られた配列が実際に遊離の葉酸に結合するか否かについて表面プラズモン共鳴法(SPR)やin-line probing法などを用いて解析を進めている状況である。天然ペプチドライブラリ用いたin vitroセレクションについてもRNAのセレクションと並行して開始しており、複数のヒト培養細胞から抽出したsmall RNA画分を限定分解し、5'末端側にSD配列および開始コドン、3'末端側に終止コドンを付加して翻訳用のライブラリとした。これにpuromycinリンカーをライゲーションによって結合させ、大腸菌由来無細胞翻訳系で翻訳したペプチドとRNAをpuromycinを介して連結することによりペプチドライブラリを構築した。さらにcMetを標的としたペプチドのin vitroセレクションを実施中である。ここまでの内容は当初平成２７年度に実施の見込みであったものであり、当初計画よりも前倒しで進行している状況である。
今後の研究の推進方策	葉酸結合RNAについては、引き続き表面プラズモン共鳴法やin-line probing法などを用いて葉酸とRNAとの結合力の評価を行ってゆく。また、葉酸を培養細胞に投与した際の標的RNAの発現量の変化を解析することにより、葉酸とRNAとの結合が生体内で及ぼす影響について解析を行う。以上の実験は平成２７年度中を目処に進める。また、天然ペプチドライブラリ用いたin vitroセレクションについては引き続きcMet結合ペプチドのセレクションを進め、結合するペプチドが得られればそのペプチドの配列や機能の解析を進める。これによってin vitroセレクションの系がうまく機能することが確認できれば、cMet以外の標的についてもin vitroセレクションを開始する。平成２７年度中にin vitroセレクション系の確立を目指し、平成２８年度にはcMet以外の標的についてのセレクションを進めたい。
次年度使用額が生じた理由	当初の計画ではin vitroセレクションに用いるための逆転写酵素、リアルタイムPCR用酵素や標的小分子およびタンパク質を固定するための担体ビースを購入する費用として物品費に６０万円を予定していた。しかしながら、実験が当初の見込みよりも順調に進みセレクション条件の検討に要した試薬類が少なくて済んだことから、およそ半額程度の予算消化にとどまった。一方で、平成２７年度から培養細胞を用いた実験を開始することに加えて、cMet以外のタンパク質標的についても実験を開始する可能性が高いため、平成２７年度においては細胞培養用の試薬や標的タンパク質の購入費用が当初予定よりもかさむことが見込まれる。そのため、平成２６年度の予算消化をできるだけ抑制し、平成２７年度に回すことを意図した。
次年度使用額の使用計画	平成２７年度所要見込額は２６年度からの繰越分を含めて1,410,320円である。このうち約10万円を学会発表のための旅費とし、残りの約130万円を試薬を購入するための物品費に充てる。物品費の内訳は逆転写酵素やリアルタイムPCR用酵素等の購入費用として約40万円、小分子およびタンパク質固定化用担体等購入費用として約40万円、細胞培養用血清やトランスフェクション試薬等の購入費用として約50万円を使用する予定である。