2015 年度実施状況報告書

天然RNAライブラリを基盤とした新規機能性RNAおよび新規機能性ペプチドの探索

研究課題

研究課題/領域番号	26560429
研究機関	東京大学
研究代表者	加藤敬行東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (90567760)
研究期間 (年度)	2014-04-01 – 2017-03-31
キーワード	機能性RNA / 機能性ペプチド / in vitroセレクション / アゴニスト / マイクロRNA
研究実績の概要	本研究課題では、特定の生体分子を標的として特異的に結合する新規機能性RNA ないし新規機能性ペプチドの探索を進めており、そのための方法論として新しいin vitro セレクション法の確立を目指している。RNAに対するSELEX法やペプチドに対するmRNAディスプレイ法などの既存のセレクション法では、完全にランダムな配列からなるRNAライブラリやペプチドライブラリの中から標的に結合する分子の探索を行うが、本手法では生体から抽出したRNAやそれを翻訳したペプチドをライブラリとして用いることにより天然に存在する機能性RNA や機能性ペプチドの探索を目指している。これまでにヒト培養細胞から抽出したsmall RNA画分を用いてRNAライブラリの構築を行い、これを用いて葉酸を標的としたin vitroセレクションを実施した。その結果、葉酸に結合するとみられるsmall RNAの配列を複数種類同定することに成功し、中でもマイクロRNA前駆体の一つであるpre-miR-125aに対する着目してその結合能の解析を進めた。また、生体内由来のRNAから翻訳したペプチドライブラリの構築に成功し、これを用いてKeap1やcMet、アンジオテンシンレセプターなどのタンパク質を標的としてペプチドのin vitroセレクションを実施した。その結果、実際にこれらの標的タンパク質に結合するペプチド配列が複数種類得られた。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 1: 当初の計画以上に進展している理由天然RNAライブラリを用いたin vitroセレクションにおいては、葉酸を標的とするセレクションに成功しており、葉酸に結合するとみられるsmall RNAの配列を複数種類見出すことができた。セレクションで得られた配列のうちいくつかのものについてはライブラリに付加したアダプター配列が存在しないと葉酸に結合できないアーティファクトであったが、ヒトマイクロRNA前駆体の一つであるpre-miR-125aについてはアダプター配列がなくても実際に葉酸に結合することが確かめられた。現在、pre-miR-125aと葉酸との結合様式や結合力の強さの解析を進めているところである。天然ペプチドライブラリ用いたin vitroセレクションについては、Keap1、cMet、アンジオテンシンレセプターを標的とするセレクションを実施した。その結果Keap1については複数種類のペプチド配列が得られており、Keap1の既知のリガンド中に含まれるペプチド配列の獲得に成功したほか、アストラタクチン由来の新規結合配列の取得に成功し、この手法が新しいペプチド-タンパク質間相互作用の探索に有効なものであることを示した。
今後の研究の推進方策	成熟体のmiR-125aはがん細胞において過剰発現しており、葉酸が前駆体pre-miR-125aに結合してその成熟体へのプロセッシングを制御することによって細胞の癌化の進行に関与する可能性があるものと考えられるため、今後さらなる検証を行う予定である。pre-miR-125aから成熟体miR-125aへのプロセッシングにはDicerと呼ばれる酵素が関与していることが知られているが、葉酸の結合がDicerの機能と競合しうるか否かについて解析を進める。また、Keap1とアストラタクチン由来のペプチド配列との結合力の解析を進める。Keap1は細胞内のタンパク質であるが、アストラタクチン由来のペプチドは細胞外ドメイン部分に相当するため、実際に相互作用するためには何らかの形でペプチド断片が細胞内に取り込まれる必要がある。そのようなメカニズムが存在するか否かについて今後検証してゆく。また、新たな標的タンパク質を用いたin vitroセレクションについても着手し、本手法の汎用性の検証を行う。
次年度使用額が生じた理由	RNAライブラリおよびペプチドライブラリの構築、in vitroセレクションが当初の想定以上に順調に進んだために、これらの作業に必要な細胞培養関連費用や標的分子固定化用ビーズ購入費用などが削減できたため、次年度に新たに必要となる実験にあてる。
次年度使用額の使用計画	ライブラリの構築についてはほぼ確立し、セレクションについてもルーチン作業化できるところまで達成したため、次年度においては既に取得されたRNAやペプチドの機能の詳細な解析を中心に進める。具体的には、分子間相互作用の解析に必要な試薬類が当初の想定よりも多く必要となる見込みであるため、これらの購入にあてることにより研究をさらに進展させる。