脳機能解析に特化した全哺乳類胚への応用可能な一世代遺伝子改変動物作成法の開発

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26640007
• 研究機関: 新潟大学
• 研究代表者: 崎村 建司 新潟大学, 脳研究所, 教授 (40162325)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 遺伝子編集 / CRISPR/CAS9 / 胚操作 / コンディショナルノックアウト / レンチウイルスベクター

研究実績の概要

本研究の目的は、マウスだけでなくマーモセットなどこれまで遺伝子改変が困難であった動物にも一世代で任意の標的遺伝子の機能解析を可能とする動物作製技術を開発することである。このために当初の計画では、CRISPR/Cas9システムを利用し、既存のCreまたはtTA/rtTA発現するドライバーマウスにより、特定の細胞に時期特異的にCas9を発現させる動物を樹立する。次にこの動物胚にレンチウイルスでガイドRNAを発現するトランスジーン導入することで、コンディショナルターゲティングに相当する遺伝子改変動物を迅速に作製する。一世代で多数の解析対象個体が作出でき、迅速に細胞選択的な標的遺伝子の機能解析が可能となる。この技術はまた、全ての胚操作可能な哺乳類に適用できることから、サルなどでの脳高次機能や疾患解析が可能になる技術になると考えた。
本研究を達成するために、まずCreあるいはtTA/rtTA依存的にCas9遺伝子を発現するノックイン型トランスジェニックマウスを樹立した。さらに、レンチウィルスベクターを用いたトランスジェニック動物を効率的に作出する手法の検討を進め、受精直後から4細胞期胚の透明体をレーザー穿孔することで、効率的に外来遺伝子を導入できることを確認した。現在、この両者を組み合わせて作出した3種類の遺伝子を持つ動物で、目的の部位で標的分子が欠損する効率などの検証等を進めているところである。
さらに、急速に進展する遺伝子編集方法の新規技術を用いて迅速に解析対象の遺伝子改変動物を樹立する方法を検討した。マウス胚に電気穿孔法でCas9、ガイドRNAさらに相同組換えDNA断片を同時に導入する方法を用いて、アミノ酸の置換や標的タンパクにタグをつける方法などに成功した。これらの本研究は、迅速な遺伝子改変動物の作製技術開発に資するものである。

研究成果

• [雑誌論文] Structure-Function Relationships between Aldolase C/Zebrin II Expression and Complex Spike Synchrony in the Cerebellum. (2015)
  • 著者名/発表者名: Tsutsumi S, Yamazaki M, Miyazaki T, Watanabe M, Sakimura K, Kano M, Kitamura K.
  • 雑誌名: J Neurosci. 巻: 35(2) ページ: 843-52.
  • DOI: 10.1523/JNEUROSCI.2170-14.2015.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Anterograde c1ql1 signaling is required in order to determine and maintain a single-winner climbing fiber in the mouse cerebellum. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kakegawa W, Mitakidis N, Miura E, Abe M, Matsuda K, Takeo YH, Kohda K, Motohashi J, Takahashi A, Nagao S, Muramatsu S, Watanabe M, Sakimura K, Aricescu AR, Yuzaki M..
  • 雑誌名: Neuron. 巻: 85(2) ページ: 316-29.
  • DOI: 10.1016/j.neuron.2014.12.020.
  • 査読あり
• [雑誌論文] STAT5 Orchestrates Local Epigenetic Changes for Chromatin Accessibility and Rearrangements by Direct Binding to the TCRγ Locus. (2015)
  • 著者名/発表者名: Wagatsuma K, Tani-Ichi S, Liang B, Shitara S, Ishihara K, Abe M, Miyachi H, Kitano S, Hara T, Nanno M, Ishikawa H, Sakimura K, Nakao M, Kimura H, Ikuta K.
  • 雑誌名: J Immunol. 巻: 195(4) ページ: 1804-14
  • DOI: 10.4049/jimmunol.1302456.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Spatiotemporal profiles of arginine vasopressin transcription in cultured suprachiasmatic nucleus. (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshikawa T, Nakajima Y, Yamada Y, Enoki R, Watanabe K, Yamazaki M, Sakimura K, Honma S, Honma KI.
  • 雑誌名: Eur J Neurosci. 巻: 42(9) ページ: 2678-89
  • DOI: 10.1111/ejn.13061
  • 査読あり
• [雑誌論文] Corticofugal GABAergic projection neurons in the mouse frontal cortex. (2015)
  • 著者名/発表者名: Tomioka R, Sakimura K, Yanagawa Y.
  • 雑誌名: Front Neuroanat. 巻: 9 ページ: 133
  • DOI: 10.3389/fnana.2015.00133. eCollection
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A CDC42EP4/septin-based perisynaptic glial scaffold facilitates glutamate clearance. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ageta-Ishihara N, Yamazaki M, Konno K, Nakayama H, Abe M, Hashimoto K, Nishioka T, Kaibuchi K, Hattori S, Miyakawa T, Tanaka K, Huda F, Hirai H, Hashimoto K, Watanabe M, Sakimura K, Kinoshita M.
  • 雑誌名: Nat Commun. 巻: 6 ページ: 10090.
  • DOI: 10.1038/ncomms10090.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Analysis of RNA metabolism in peripheral WBCs of TDP-43 KI mice identifies novel biomarkers of ALS. (2015)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa M, Hara-Miyauchi C, Ohta H, Sakimura K, Okano H, Okano HJ. :
  • 雑誌名: Neurosci Res. 巻: pii: S0168-0102(15) ページ: 00289-8.
  • DOI: 10.1016/j.neures.2015.11.009.
  • 査読あり
• [学会発表] ラットES細胞神経生物学から遺伝子改変動物作製の効率化：妊娠維持障害の改善 (2015)
  • 著者名/発表者名: 中務胞,夏目里恵、高田華子、崎村建司
  • 学会等名: MB2015（第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生学会合同大会）
  • 発表場所: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 2015-12-01
  • 国際学会
• [学会発表] Localization of neuropathic pain-related protein,BEGAIN in the spinal dorsal horn. (2015)
  • 著者名/発表者名: T.Katano、M.Watanabe, M.Yamazaki, M.Abe, I.Yao, K.Sakimura, S.Ito
  • 学会等名: Neuroscience2015
  • 発表場所: Chicago,USA
  • 年月日: 2015-10-21
  • 国際学会
• [学会発表] Dual effects of serotoninergic inputs on the local circuits regulating the corticotropin-releasing factor neurons in the paraventricular nucleus of the hypothalamus: An electrophysioligical study using the CRF-Venus Δneo mouse. (2015)
  • 著者名/発表者名: T.Sato、T.Sugaya. T.Fuse, K.Uchida, A.H.Talukder,J.Kono, N.Sugimoto,S.Yamagata, M.Abe, M.Yamazaki, A.Fukuda,K.Sakimura,K.Itoi
  • 学会等名: Neuroscience2015
  • 発表場所: Chicago,USA
  • 年月日: 2015-10-19
  • 国際学会
• [学会発表] Arc/arg3.1 knockout mice exhibit behavioral flexibility in a serial reversal learning task. (2015)
  • 著者名/発表者名: H.Okuno、T.Endo,R.Kim,K.Minatohara,A.Araki,M.Abe,M.Kakeyama,K.Sakimura,H.Bito
  • 学会等名: Neuroscience2015
  • 発表場所: Chicago,USA
  • 年月日: 2015-10-19
  • 国際学会
• [学会発表] Behavioral analysis of GluD1 deficient mice with the pure genetic background. (2015)
  • 著者名/発表者名: C.Nakamoto、R.Natsume, E.Nakatsukasa,M.Abe,M.Watanabe, K.Sakimura
  • 学会等名: Neuroscience2015
  • 発表場所: Chicago,USA
  • 年月日: 2015-10-18
  • 国際学会
• [学会発表] Molecular determinants underlying heterogeneity in AMPAR content across CA1 Schaffer collateral synapses. (2015)
  • 著者名/発表者名: M.Yamasaki、M.Fukaya, M.Yamazaki, M.Abe, K.Sakimura, M.Watanabe
  • 学会等名: Neuroscience2015
  • 発表場所: Chicago,USA
  • 年月日: 2015-10-18
  • 国際学会
• [学会発表] 生命科学リソースとしての遺伝子改変動物の未来 (2015)
  • 著者名/発表者名: 﨑村建司
  • 学会等名: がん・ゲノム・脳-3分野合同シンポジウム
  • 発表場所: 一橋大学一橋講堂（東京都千代田区）
  • 年月日: 2015-08-19
  • 招待講演
• [学会発表] 低親和性カイニン酸受容体サブユニット、GluK2及びGluK3欠損マウスの行動解析 Analysis of behavioral phenotypes in low affinity kainate-type subunits deficient mice (2015)
  • 著者名/発表者名: 渡辺和泉、今野幸太郎、明石馨、阿部学、夏目里恵、渡辺雅彦、崎村建司
  • 学会等名: 第38回日本神経科学会
  • 発表場所: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 2015-07-29
  • 国際学会
• [学会発表] ラット胚移植における三種混合麻酔の有用性 (2015)
  • 著者名/発表者名: 中務胞、夏目里恵、中本千尋、崎村建司
  • 学会等名: 第62回実験動物学会
  • 発表場所: 京都テルサ（京都府京都市）
  • 年月日: 2015-05-29
  • 国際学会
• [備考] 新潟大学脳研究所細胞神経生物学
  • URL: http://www.bri.niigata-u.ac.jp/~cellular/