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申請者が開発したランダムスキャン方式2光子励起顕微鏡は高時間分解能により従来の2光子励起顕微鏡の限界を打ち破る。本研究はこの装置の高速性を生かして電位感受性色素により同期して活動電位を発する複数ニューロンの組み合わせを正確に抽出し、局所神経回路の構造を明らかにするとともに、単一神経細胞の多点膜電位記録を行い、神経細胞樹状突起における膜電位の空間・時間変化パタ ーンを解析することを目指している。すでに電位感受性色素を培養神経細胞に導入しての多点活動電位計測に成功していたが、本研究では脳スライスあるいは動物個体の脳に適用して局所神経回路の構造を明らかにすることを目的とした。培養神経細胞での計測に はDiOとDPAの2種類の色素の組み合わせを電位感受性色素として用いたが、DiOは疎水性が高く、通常の培地添加法では全く染色できなかったので、遺伝子銃を用いて培養神経細胞のDiO染色を行った。昨年度までに脳スライスでは遺伝子銃によりDiO染色は細胞へのダメージが大きくて不可能であること、培地添加法では脳切片への浸透が十分でないことが判明し、今年度は予め生きた動物脳にDiOを注入し、組織内の拡散を数日待って、脳切片を作製する方法を試みた。また、DiO類似化合物をテストし、Fast DiOとNeuroDiOは膜浸透性や親水性の違いから、DiOよりも脳内注入法に適していることが判明した。以上の結果、十分な脳切片標本の神経細胞の染色が得られ、複数の神経細胞からの活動電位の記録が得られた。
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