早老症候群霊長類モデルの開発

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26640053
• 研究機関: 滋賀医科大学
• 研究代表者: 伊藤 靖 滋賀医科大学, 医学部, 准教授 (90324566)
• 研究分担者: 土屋 英明 滋賀医科大学, 動物生命科学研究センター, 技術専門職員 (10378440) ; 佐々木 えりか 公益財団法人実験動物中央研究所, 応用発生学研究センター, センター長 (70390739) ; 依馬 正次 滋賀医科大学, 動物生命科学研究センター, 教授 (60359578) ; 小笠原 一誠 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (20169163)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 老化 / 癌 / トランスレーショナルリサーチ / 病理学 / 霊長類モデル / レンチウイルスベクター / 遺伝子編集

研究実績の概要

カニクイザルの組織からゲノムDNAを精製した。これをもとにPCRによりWerner RecQ DNAヘリカーゼのゲノム遺伝子の一部を単離した。この遺伝子をpCAG-EGxxFPプラスミドベクターにクローニングした。一方、MITのCRISPR guide RNA設計サイトを利用し、カニクイザルWerner RecQ DNAヘリカーゼに特異的な塩基配列を決定した。これに由来する配列をCRISPR-Cas9システムを機能させるプラスミドベクターにクローニングした。これらのベクターを293T細胞、COS7細胞にリポフェクション法でトランスフェクトしたところ、EGFPの発現が蛍光顕微鏡、フローサイトメーターを用いて確認され、作製したguide RNA及びCas9発現ベクターが機能し、カニクイザルWerner RecQ DNAヘリカーゼ遺伝子を切断することが判明した。
また、microRNAを用いたカニクイザルWerner RecQ DNAヘリカーゼ特異的遺伝子ノックダウウンベクターを作製した。カニクイザルWerner RecQ DNAヘリカーゼcDNA配列をもとにmicroRNA用配列を数カ所選択し、microRNAを発現するレンチウイルスベクターにクローニングした。レンチウイルスを作製し、カニクイザル細胞に感染させたところ、マーカー蛍光タンパク質の発現が確認された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

遺伝子改変サルのサルの作製に向けて、必要なベクターの作製がほぼ終了した。CRISPR-Cas9系を用いた遺伝子改変では、プラスミドベクターの作製が終了し、カニクイザルのゲノム遺伝子を切断することが確認できた。miRNA導入用のレンチウイルスベクターは一部の作製が終了し、カニクイザルの細胞に導入することに成功した。現在、カニクイザル受精卵への導入条件を検討中である。

今後の研究の推進方策

カニクイザル細胞にCRISPR-Cas9プラスミドベクターを導入した細胞の遺伝子塩基配列の解析を行い、変異を確認する。miRNA用レンチウイルスベクターを導入したカニクイザル細胞でmRNAの発現を確認する。これらの細胞を用いて、細胞分裂能、遺伝子修復能など機能の変化を測定する。次に、プラスミドベクターまたはレンチウイルスベクターをカニクイザル卵細胞に顕微授精時に導入する。遺伝子改変の成否を確認後、仮親に移植する。

研究成果

• [雑誌論文] Efficacy of repeated intravenous administration of peramivir against highly pathogenic avian influenza A (H5N1) virus in cynomolgus macaques. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kitano M, Itoh Y, Ishigaki H, Nakayama M, Ishida H, Pham VL, Arikata M, Shichinohe S, Tsuchiya H, Kitagawa N, Kobayashi M, Yoshida R, Sato A, Le QM, Kawaoka Y, Ogasawara K
  • 雑誌名: Antimicrobial Agents and Chemotherapy 巻: 58 ページ: 4795-4803
  • DOI: 10.1128/AAC.02817-14
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Protective Efficacy of Passive Immunization with Monoclonal Antibodies in Animal Models of H5N1 Highly Pathogenic Avian Influenza Virus Infection (2014)
  • 著者名/発表者名: Itoh Y, Yoshida R, Shichinohe S, Higuchi M, Ishigaki H, Nakayama M, Pham VL, Ishida H, Kitano M, Arikata M, Kitagawa N, Mitsuishi Y, Ogasawara K, Tsuchiya H, Hiono T, Okamatsu M, Sakoda Y, Kida H, Ito M, Le QM, Kawaoka Y, Miyamoto H, Ishijima M, Igarashi M, Suzuki Y, Takada A
  • 雑誌名: PLoS Pathogens 巻: 10 ページ: e1004192
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1004192
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Disease severity is associated with differential gene expression at the early and late phases of infection in non-human primates infected with different H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses (2014)
  • 著者名/発表者名: Muramoto Y, Shoemaker J, Le Mai, Itoh Y, Tamura D, Sakai-Tagawa Y, Imai H, Uraki R, Takano R, Kawakami E, Ito M, Okamoto K, Ishigaki H, Mimuro H, Sasakawa C, Matsuoka Y, Noda T, Fukuyama S, Ogasawara K, Kitano H, Kawaoka Y
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: 88 ページ: 8981-8997
  • DOI: 10.1128/JVI.00907-14
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 霊長類モデルを用いたインフルエンザウイルスの病原性の解明と予防・治療法の開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 靖
  • 学会等名: 第６０回日本病理学会秋期特別総会
  • 発表場所: 国立劇場おきなわ（沖縄県浦添市）
  • 年月日: 2014-11-21