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2014 年度 実施状況報告書

ハプロイドES細胞を用いたiPS細胞生成過程の制御因子の探索

研究課題

研究課題/領域番号 26640062
研究機関奈良県立医科大学

研究代表者

堀江 恭二  奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (30333446)

研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2016-03-31
キーワード遺伝子 / ゲノム / 再生医学 / バイオテクノロジー / 発生・分化
研究実績の概要

本研究では、ハプロイドゲノムを有すマウスES細胞を用いて、iPS細胞の生成効率を高める遺伝子変異を同定することを目指している。このために、まずはハプロイドES細胞に対して、ジーントラップ法でゲノムワイドな変異を導入し、その後、ES細胞をEpiSCへ分化誘導し、さらに、EpiSCからiPS細胞へ初期化させ、初期化の効率に影響を与える遺伝子変異を同定する。しかし、ハプロイドES細胞はある一定の頻度でディプロイド化し、これが実験の効率に大きく影響した。ゲノムワイドに遺伝子を破壊するためには、相当数のハプロイドES細胞を用いる必要がある。そこで、ヘキスト染色後にUVレーザーを用いたFACS sortingを行ってハプロイドのDNA量の細胞を回収するのだが、十分な生存細胞を安定的に取得するのが容易ではなかった。一方、本研究課題では、ハプロイドES細胞でスクリーニングしてきた遺伝子をCRISPR/Casシステムで迅速に破壊して、その機能を確定させることを計画していたが、この点については、ES細胞において、タモキシフェン添加によりCas9の発現を簡便に誘導する実験系を開発し、順調に進展しつつある。CRISPR/Casシステムにおいては、最近、ゲノムワイドに遺伝子破壊をするためのguide RNAライブラリが開発された。そこで、上述のCas9誘導型のES細胞株に対してguide RNAライブラリを導入することで、ハプロイドES細胞の場合と同様に、両アレルに変異を有すES細胞を多数取得できると考えた。現在、guide RNAライブラリのES細胞株への導入を終え、その評価を行っている。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ハプロイドES細胞の利用が困難であったために、研究方法を再考する必要があったものの、新たな研究計画により、本来の目的に沿った研究を遂行できている。

今後の研究の推進方策

Cas9誘導型ES細胞株とguide RNAライブラリの併用による遺伝子破壊の効果を検証する。さらに、ES細胞を分化誘導したのちにCas9の活性を誘導すれば、当初の実験計画以上に、目的の表現型を示す細胞株を効率的に取得できると期待される。

次年度使用額が生じた理由

実験上の困難を解決するために、Cas9誘導型ES細胞株を用いた実験系を開始し、次年度使用額が生じた。

次年度使用額の使用計画

上記の実験系を検証するための細胞培養用試薬を購入する。

  • 研究成果

    (4件)

すべて 2014

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (3件) (うち招待講演 1件)

  • [雑誌論文] Simulation and estimation of gene number in a biological pathway using almost complete saturation mutagenesis screening of haploid mouse cells2014

    • 著者名/発表者名
      Masahiro Tokunaga, Chikara Kokubu, Yusuke Maeda, Jun Sese, Kyoji Horie, Nakaba Sugimoto, Taroh Kinoshita, Kosuke Yusa, Junji Takeda
    • 雑誌名

      BMC Genomics

      巻: 15 ページ: 1016

    • DOI

      10.1186/1471-2164-15-1016

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] ホモ変異体マウスES細胞バンクを用いた包括的遺伝子機能解析2014

    • 著者名/発表者名
      堀江恭二、吉田純子
    • 学会等名
      第37回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      2014-11-25 – 2014-11-27
    • 招待講演
  • [学会発表] Rapid identification of homozygous mutant mouse embryonic stem cell clones showing differentiation resistant or differentiation prone phenotype2014

    • 著者名/発表者名
      Junko Yoshida, Kyoji Horie
    • 学会等名
      Global Controls in Stem Cells
    • 発表場所
      Biopolis, Syngapore
    • 年月日
      2014-11-05 – 2014-11-07
  • [学会発表] Live cell imaging for the analysis of cellular heterogeneity in mouse embryonic stem cell mutant clones identified by forward genetic screening2014

    • 著者名/発表者名
      Junko Yoshida, Kyoji Horie
    • 学会等名
      12th Annual Meeting of International Society for Stem Cell Research
    • 発表場所
      Vancouver, Canada
    • 年月日
      2014-06-18 – 2014-06-21

URL: 

公開日: 2016-05-27  

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