| 研究課題/領域番号 |
26640107
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
秋山 暢丈 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (00338865)
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| 研究分担者 |
斎藤 三郎 東京慈恵会医科大学, 医学部, 准教授 (10186934)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 癌免疫 |
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| 研究実績の概要 |
初年度である本年はB16メラノーマの抑制活性を持つCTLを誘導する癌抗原のスクリーニング法の開発に取り組んだ。 理研のファントムライブラリー(pFLCIII)と入れ替える為に、本研究室で既に開発されているpSTR系ベクターのマルチクローニングサイトを改変してた。またモデル系のcDNAをpFLCIIIに導入し、変換のモデルを作成した。この際、ライブラリーのかなりのクローンのcDNAの構造がI-Ceu,PI-SceIの制限酵素による入れ替えが不可能である事が判明し、当初の計画以外の方法による変換が必要となった。
全てのcDNAに含まれているSfiIによる変換もATTATGGCCという配列がオープンリーディングフレームの前に有る為、コザックルールの関係で使用が不可能であった為、大腸菌の相同組み換え関連遺伝子を用いて行うベクターのコンバージョンのシステムによる解決を試みた。
コストおよび効率性を考慮するとラムダファージのexo/bet/gam遺伝子産物によるin vitroの相同組み換え法であるSLICE法が適当と考え、前述遺伝子産物を含む、組み換え活性を持つ大腸菌の作成を試みた。この大腸菌の抽出液を用いた相同組み換えを行う事は出来なかった。また、この大腸菌への電気削孔法による組み換えも不可であったので、他の組み換えの方法（Gibson Assemblyなど）を検討中である。 また、更なるSLICE法の検討も行っている。
リポゾーム自体の解析、および改良は順調に行われ、抗原を発現させる際にある種の低分子化合物を添加するすると抗原のCTL誘導能が増加する知見が得られ、この観点からの解析を進めており、一部は学会に報告した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
抗原の提供に重要な試料であるファントムライブラリーのcDNAをブロック１を用いて行う計画で実際に購入を行っているが、購入後、全てのcDNAの構造が当初の予想のホーミングエンドヌクレアーゼに挟まれた構造だけではなく、SfiIに挟まれているものが大部分であった。 また、この際、cDNAのまえにATTATGGCCという形のコザックルールがリンカーとして挿入されていた。 この為、相同組み換えを用いたベクターの入れ替えを行う必要があり、コスト等を勘案して、SLICE,Gibson assemblyなどの技術によって、コザックルールの削除とサブクローニングを同時に行うプロトコルの開発が必要となったが、いまだ解決されていない。
この入れ替えは本実験計画で必要不可欠であり、全体の計画の進捗が遅れる原因となっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本計画の根幹に関わる発現ベクターライブラリーの変換法の確率が急務となっている。Co-transformationを含む方法の検討を速やかに行うほか、この方法がうまく行かない時には、原理的にまたコスト的にも次善の策であるがPCRを用いた変換法の検討も行うものとする。
これらの完成を待って、速やかにｃDNAのスクリーニングを行うものとする。
また、CTL誘導法の効率化を今回発見された糸口から推し進めるものとする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実質的にほぼ同額であると考えている。
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| 次年度使用額の使用計画 |
特に追加すべき事はない。
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