| 研究課題/領域番号 |
26640107
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
秋山 暢丈 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (00338865)
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| 研究分担者 |
斎藤 三郎 東京慈恵会医科大学, 医学部, 准教授 (10186934)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | CTL / 癌ワクチン |
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| 研究実績の概要 |
OVA蛋白質を改変したモデル蛋白質による発現クローニングの条件の決定の為、前年度に作成したベクターを用いて、大腸菌、ヒト哺乳類細胞によって、抗原蛋白質を発現させ、カチオン性リポゾームと混合し、マウスへの免疫を行い、CTL誘導能を計測した。 その結果、ヒト由来、大腸菌由来のOVA蛋白質はニワトリ由来の抗原よりもCTL誘導能が低い事が確認され、様々な糖鎖修飾酵素の阻害剤の存在下で発現した抗原もCTL誘導能の違いが認められなかった。 本課題のアジュバントを用いるに当たって、ニワトリ由来の糖鎖構造が重要であることが確認されたため、ニワトリ細胞とモデル細胞の細胞融合を行い、その溶解液を抗原として、アジュバントと共に免疫する方法の評価を目指した。
まずニワトリの蛍光たんぱく質を発現する細胞をレトロウイルスにより作成した。そして異なる蛍光蛋白質を発現させ、異なる薬剤耐性を持つマウス消火器癌由来の細胞を作製し、その細胞融合の方法を検討した。
検討した結果、不活化したセンダイウイルスを用いると効率良く細胞融合が出来たが、両薬剤に耐性なステーブルなクローンをとる事は出来なかった。その為、ニワトリ細胞とモデル細胞の融合を行い、細胞融合の翌日に溶解液を作成し、マウスに免疫する事でOVAに対するCTL活性を検討した。 その結果、融合した細胞の抽出液とアジュバントの投与により,CTLが誘導できる事を見出し、消火器癌に対するワクチン療法への応用を検討している。
また、ニワトリOVA自体が特殊なアジュバント活性が予測されるので、クロスリンカーにより、蛋白質を共有結合で連結し、その複合体とアジュバントの投与による利用法も同時に検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
一番重要な理研のファントムライブラリーのバルクでの発現ベクターへの変換がライブラリーのプラスミドを含んだ大腸菌の割合が異なる事、およびコザックルールによりSfiIのみの入れ替えでは目的のｃDNAが発現できない事などの理由によりｃDNAのバルク処理によるライブラリーの変換が困難である事が判明したが、新しいベクターと変換の手法の開発に時間がかかった。
しかしながら、細胞融合による新しい癌免疫誘導法の可能性が浮かび、実用的な手法の開発が期待でき、効率的な開発が必要とされる。
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| 今後の研究の推進方策 |
主要な課題でありルーチン的な仕事で結果が出せるｃDNAによる癌抗原の発現クローニングをなんとか形に持っていくことが必要と考えている。。
当課題のアジュバントを用いた際の、ニワトリ由来の糖鎖構造の有用性が確認されたため、この知見を最大限活用した細胞融合に関連した抗原作成法および新しい癌抗原免疫法の開発も進める事とする。
計画がかなり遅れている為、スクリーニングも考慮して、一年研究期間の延長も考慮して、必要な実験に注力する必要がある。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
用いるライブラリーでcDNAの前にコザックルールのあるスタートコドンが存在していたため、ライブラリーの変換に技術的問題が発生した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
蒸気の問題を解決する方法の検討と、細胞融合を用いた癌細胞抽出液のＣＴＬ誘導へのアジュバントの応用も同時に進める事とした。
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