H. pyloriの起源を求めて

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26640114
• 研究機関: 大分大学
• 研究代表者: 山岡 吉生 大分大学, 医学部, 教授 (00544248)
• 研究分担者: 鈴木 留美子 大分大学, 医学部, 助教 (70599092)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: ヘリコバクター・ピロリ / ヘリコバクター属 / 動物 / 進化

研究実績の概要

Helicobacter pylori (H. pylori)は胃癌のリスクファクターとして知られており、宿主であるヒトとの進化的並行性を利用して菌の系統関係から宿主である人類集団の系統関係や移動経路の推定がなされている。しかし、H. pyloriがどのようなソースから人類への感染を確立つしたのかは謎である
我々はこれまで、世界各地のH. pyloriゲノムを解析してきたが、アラスカ先住民から採取した菌の中に、部分配列や16s rRNAは通常のH. pyloriに近いが、ゲノム構造が他と大きく異なり、大型猫科動物を宿主とするH. acinonychisに似ている株を発見した。このような特異なゲノム構造は当初１株のみに見られたが、その後のゲノムDNAシーケンシングによって、アラスカ９株中４株が特異なゲノム構造を持っていることがわかった。また、GenBankに登録されているカナダの菌にも同様のゲノム構造が見られ、アメリカ大陸の極北部に特異的な菌だと考えられる。
アメリカ大陸北部原住民の食習慣から、我々はこのような特異的な菌が草食獣に由来するのではないかという仮説を立てた。また、病死したトナカイの胃内にH. pylori様の菌が見られたという動物衛生研究所のレポートを見いだし、動物衛生研究所から、H. pylori様の細菌を含むトナカイおよびオセロットの胃の組織のパラフィンブロックを提供していただいた。オセロットの方が含まれている菌が多いので、まずコントロールとしてオセロットサンプルからDNAを抽出し、16s rRNAのPCRを行ったがバンドは検出されなかった。また、サファリパーク（姫路セントラルパーク）のご協力により、８種の草食獣の糞便サンプルを45検体採取していただいて、16s rRNAのPCRを行い、こちらは45検体中37検体でバンドを確認している。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

技術補佐員の移動など人員体制の変動があり、当初の予定より作業が遅延している。コントロール実験として行った16s rRNAのPCRで、細菌を多く含むオセロットの胃組織DNAからバンドが検出できなかった要因としては、DNAの断片化が考えられる。抽出されたDNA中の断片が、設定したプライマー間より短い場合、PCRでは増幅ができない。これに対しては、今年度は異なるアプローチを行う予定である。
大学内共通機器として次世代シーケンサーが導入されたが、当初は学内に利用経験者がいなかったので、高価な試薬やDNAサンプルを無駄にしないためにも、学内で実験手技が高い実験者にプロトコルを確立してもらい、本研究室のメンバーがその実験者から技術の習得に努めた。昨年度はトレーニング期間として、ふんだんに取得可能な培養菌体からのDNAを用いてシーケンスを行ったが、量に限りがある本研究のサンプルはまだ用いていない。今年度は実験担当者の手技も向上したので、実験を推進する。

今後の研究の推進方策

あオセロットの胃組織DNAからは16s rRNAのバンドは検出されなかったが、トナカイサンプルについても、まずは16s rRNAのPCRを行う予定である。オセロットサンプルと同じようにバンドが検出されない場合は、次世代シーケンサーによる網羅的なシーケンスを試みる。次世代シーケンサーから得られるショートリードデータは、宿主動物DNAと菌DNAの混合物となる。顕微鏡像では胃内の細菌は１種のみが確認されており、宿主と菌の２種の判別を行えばよい。哺乳類とHelicobacter属細菌のゲノムはGC含量が大きく異なるのでGC含量だけでもある程度判別できるが、我々はバイオインフォマティクス的手法を取り入れ、３塩基配列の出現頻度に基づいた判別を行う。判別されたデータはde-novoアセンブリで繋げて相同性検索を行うか、あるいはアメリカ大陸北部特異株に対してリファレンスマッピングを試み、近縁性を探索する。
動物糞便からのDNAからは16s rRNAのバンドが検出され、細菌のDNAの状態は比較的良好であると思われる。ただしサンプルはさまざまな細菌のDNAの混合物である。今回の我々の目標は網羅的な腸内細菌叢の調査ではなく、草食動物の消化管細菌からH. pyloriと関連性のある菌を探し出すことなので、ターゲット遺伝子を設定し、PCR およびサンガーシーケンスで確認を行う。
ターゲット遺伝子は、H. pyloriの中では最も祖先種に近いhpAfrica2グループの菌と、アメリカ大陸北部特異株の遺伝子から選定する。これらの菌の系統特異的遺伝子を推定し、それに対するプライマーを設計して動物糞便DNAからの検出を試みる。

次年度使用額が生じた理由

本年度は、検体を得てDNAを抽出してPCRを行う段階にとどまっているため、多くは既存の試薬などで実験を遂行することができたため、本研究用の物品を使用する必要がなかった。

次年度使用額の使用計画

次年度は、次世代シーケンサーを用いた解析などが予定されており、多量の消耗品が必要となる。

研究成果

• [雑誌論文] Identification of Helicobacter pylori infection in symptomatic patients in Surabaya, Indonesia, using five diagnostic tests (2015)
  • 著者名/発表者名: Miftahussurur M, Shiota S, Suzuki R, Matsuda M, Uchida T, Kido Y, Kawamoto F, Maimunah U, Adi P, Rezkitha Y, Nasronudin, Nusi I, Yamaoka Y
  • 雑誌名: Epidemiol Infect 巻: 143 ページ: 986-996
  • DOI: 10.1017/S095026881400154X
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Search for novel candidate mutations for metronidazole resistance in Helicobacter pylori using next generaton sequencing (2015)
  • 著者名/発表者名: Binh TT, Suzuki R, Trang TT, Kwon DH, Yamaoka Y
  • 雑誌名: Antimicrob Agents Chemother 巻: 59 ページ: 2343-2348
  • DOI: 101128/AAC 04852-14
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Prevalence of Helicobacter pylori infection and atrophic gastritis in patients with dyspeptic symptoms in Myanmar (2015)
  • 著者名/発表者名: Myint T, Shiota S, Vilaichone RK, Ni N, Aye TT, Matsuda M, Tran TT, Uchida T,Mahachai V, Yamaoka Y
  • 雑誌名: World J Gastroenterol 巻: 21 ページ: 629-236
  • DOI: 10.3748/wjg.v21.i2.629
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Differences in interleukin 8 expression in Helicobacter pylori-infected gastric mucosa tissues from patients in Bhutan and the Dominican Republic (2015)
  • 著者名/発表者名: Nagashima H, Iwatani S, Cruz M, Jiménez Abreu JA, Tronilo L, Rodriacuteguez E, Disla M, Terao H, Uchida T, Mahachai V, Vilaichone RK, Tshering L, Mitsui T, Shiota S, Graham DY, Yamaoka Y
  • 雑誌名: Hum Pathol 巻: 46 ページ: 129-136
  • DOI: 10.1016/j.humpath.2014.10.006
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Biomarkers for Helicobacter pylori infection and gastroduodenal diseases (2014)
  • 著者名/発表者名: Shiota S, Yamaoka Y
  • 雑誌名: Biomark Med 巻: 8 ページ: 1127-1137
  • DOI: 10.2217/bmm.14.72
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Extremely low Helicobacter pylori prevalence in North Sulawesi, Indonesia and identification of a Maori-tribe type strain: a cross sectional study (2014)
  • 著者名/発表者名: Miftahussurur M, Tuda J, Suzuki R, Kido Y, Kawamoto F, Matsuda M, Tantular IS, Pusarawati S, Nasronudin, Harijanto PN, Yamaoka Y
  • 雑誌名: Gut Pathog 巻: 6 ページ: e46
  • DOI: 10.1186/s13099-014-0042-0
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Genetic battle between Helicobacter pylori and humans. The mechanism underlying homologous recombination in bacteria, which can infect human cells. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hanada K, Yamaoka Y
  • 雑誌名: Microbes Infect 巻: 16 ページ: 833-839
  • DOI: 10.1016/j.micinf.2014.08.001
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Helicobacter pylori from gastric cancer and duodenal ulcer show same phylogeographic origin in the Andean region in Colombia. (2014)
  • 著者名/発表者名: Shiota S, Suzuki R, Matsuo Y, Miftahussurur M, Tran TT, Binh TT, Yamaoka Y
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9 ページ: e105392
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0105392
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Identification of the genes that contribute to lactate utilization in Helicobacter pylori (2014)
  • 著者名/発表者名: Iwatani S, Nagashima H, Reddy R, Shiota S, Graham DY, Yamaoka Y
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9 ページ: e103506
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0103506
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Helicobacter pylori infection introduces DNA double-strand breaks in host cells (2014)
  • 著者名/発表者名: Hanada K, Uchida T, Tsukamoto Y, Watada M, Yamaguchi N, Yamamoto K, Shiota S, Moriyama M, Graham DY, Yamaoka Y
  • 雑誌名: Infect Immun. 巻: 82 ページ: 4182-4189
  • DOI: 10.1128/IAI.02368-14
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Helicobacter pylori virulence and cancer pathogenesis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yamaoka Y, Graham DY
  • 雑誌名: Future Oncol. 巻: 10 ページ: 1487-1500
  • DOI: 10.2217/fon.14.29
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Virulence genes of Helicobacter pylori in the Dominican Republic (2014)
  • 著者名/発表者名: Shiota S, Cruz M, Abreu JA, Mitsui T, Terao H, Disla M, Iwatani S, Nagashima H, Matsuda M, Uchida T, Tronilo L, Rodriacuteguez E, Yamaoka Y
  • 雑誌名: J Med Microbiol 巻: 63 ページ: 1189-1196
  • DOI: 10.1099/jmm.0.075275-0
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Complete genome sequences of eight Helicobacter pylori strains with different virulence factor genotypes and methylation profiles, isolated from patients with diverse gastrointestinal diseases on Okinawa island, Japan, determined using PacBio single-molecule real-time technology (2014)
  • 著者名/発表者名: Satou K, Shiroma A, Teruya K, Shimoji M, Nakano K, Juan A, Tamotsu H, Terabayashi Y, Aoyama M, Teruya M, Suzuki R, Matsuda M, Sekine A, Kinjo N, Kinjo F, Yamaoka Y, Hirano T
  • 雑誌名: Genome Announc 巻: 2 ページ: e00286-14
  • DOI: 10.1128/genomeA.00286-14
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Discovery of novel mutations for clarithromycin resistance in Helicobacter pylori by using next-generation sequencing (2014)
  • 著者名/発表者名: Binh TT, Shiota S, Suzuki R, Matsuda M, Trang TT, Kwon DH, Iwatani S, Yamaoka Y
  • 雑誌名: J Antimicrob Chemother 巻: 69 ページ: 1796-1803
  • DOI: 10.1093/jac/dku050
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Strategy for the treatment of Helicobacter pylori infection (2014)
  • 著者名/発表者名: Shiota S, Yamaoka Y
  • 雑誌名: Curr Pharm Des 巻: 20 ページ: 4489-4500
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] ヘリコバクター・ピロリとは何もの ー病原性の歴史も含めてー (2014)
  • 著者名/発表者名: 山岡 吉生
  • 雑誌名: 化学療法の領域 巻: 30 ページ: 30-38
• [雑誌論文] ヘリコバクター・ピロリの病原因子と分子疫学に関する研究 (2014)
  • 著者名/発表者名: 山岡 吉生
  • 雑誌名: 化学療法の領域 巻: 30 ページ: 100-107
• [雑誌論文] Helicobacter pylori 感染症の疫学と感染経路 (2014)
  • 著者名/発表者名: 永島裕之、手島理絵、山岡 吉生
  • 雑誌名: Helicobacter Research 巻: 18 ページ: 28-31
• [学会発表] The diversity of Helicobacter pylori: correlation to laboratory diagnosis (2014)
  • 著者名/発表者名: Yamaoka Y
  • 学会等名: 9th National Symposium & Workshop of Indonesia Antimicrobiol Resistance Watch and Annual Scientific Meeting of Indonesian Society for Clinical Microbiologist
  • 発表場所: ジャカルタ（インドネシア）
  • 年月日: 2014-11-29 – 2014-11-30
  • 招待講演
• [学会発表] Genomic diversity of Helicobacter pylori in Asia (2014)
  • 著者名/発表者名: Yamaoka Y
  • 学会等名: Asian Pacific Digestive Week
  • 発表場所: バリ島（インドネシア）
  • 年月日: 2014-11-22 – 2014-11-25
  • 招待講演
• [学会発表] CagAの差異で、胃癌の発症率の地域差を説明することは本当にできるのか？ (2014)
  • 著者名/発表者名: 山岡吉生
  • 学会等名: 日本ヘリコバクター学会
  • 発表場所: ステーションカンファレンス東京（東京都千代田区)
  • 年月日: 2014-06-28 – 2014-06-29
• [学会発表] Does the difference of CagA phenotype explain the geographic differences in gastric cancer incidence? (2014)
  • 著者名/発表者名: Yamaoka Y
  • 学会等名: 4th Mongolian Digestive Disease Week 2014
  • 発表場所: ウランバートル（モンゴル）
  • 年月日: 2014-06-18 – 2014-06-19
  • 招待講演
• [学会発表] Self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: the organoids (2014)
  • 著者名/発表者名: Yamaoka Y
  • 学会等名: 4th Mongolian Digestive Disease Week 2014
  • 発表場所: ウランバートル（モンゴル）
  • 年月日: 2014-06-18 – 2014-06-19
  • 招待講演
• [学会発表] The relations of bacterial and host factors in Helicobacter pylori infected gastric mucosa (2014)
  • 著者名/発表者名: Yamaoka Y, Cruz M, Disla M, Graham DY, Iwatani S, Jimenez JA, Nagashima H
  • 学会等名: X Congreso International de Investigacion Cientifica
  • 発表場所: サントドミンゴ（ドミニカ共和国）
  • 年月日: 2014-06-12 – 2014-06-14
  • 招待講演
• [学会発表] Molecular epidemiology and outcome of Helicobacter pylori in Laos (2014)
  • 著者名/発表者名: Vannarath S, Vilaichone RK, Rasachak B, Mahachai V, Mairlang P, Yamaoka Y
  • 学会等名: アメリカ消化器病学会
  • 発表場所: シカゴ（米国）
  • 年月日: 2014-05-03 – 2014-05-06
• [学会発表] The relations of bacterial and host factors of IL-8 expression in Helicobacter pylori infected gastric mucosa (2014)
  • 著者名/発表者名: Nagashima H, Iwatani S, Cruz M, Jimenez JA, Mahachai V, Vilaichone RK, Uchida T, Shiota S, Graham DY, Yamaoka Y
  • 学会等名: アメリカ消化器病学会
  • 発表場所: シカゴ（米国）
  • 年月日: 2014-05-03 – 2014-05-06
• [図書] 胃がんリスク検診（ABC検診）マニュアル：改正2版 (2015)
  • 著者名/発表者名: 山岡 吉生
  • 総ページ数: 3
  • 出版者: 南山堂
• [備考] http://www.med.oita-u.ac.jp/phealth2/index.html