研究課題
血清・血漿中のタンパク質分析は組織、臓器に比べて非常に難しく、満足な分析が出来ているとは言い難い。また、ヒトの組織、特に健常者の組織を直接調べることは困難である。本研究は、3種類のストレス関連障害マウス（①不安障害を示すピロカルピン投与マウス、②ストレス障害を示す変異マウス、③うつ様症状を示す慢性ストレス負荷マウス）を対象に、ストレス関連障害と脳内変動に相関する血漿タンパク質の変動を徹底的に分析する。これによって、マーカーという概念にとらわれず、血漿プロテオームの持つ新たな可能性と観点を見出すことを目的とした研究である。そこで、平成26年度は主に以下の３点を進めた。(1)モデルマウスの飼育・行動解析・試料収集：モデルマウス①、②について、オープンフィールドテストと明暗選択テストを行い、その後、海馬、前頭皮質、血漿の収集を行った。モデルマウス③に関しては、強制水泳実験における無動時間を測定し、視床下部、海馬、血漿の収集をおこなった。(2)血漿のプロテオーム・ペプチドーム解析法の確立と、血漿成分分析の開始：安定同位体標識試薬の一種である Isobaric Tag 法と独自に開発した血漿タンパク質分画法（本年度特許取得）を組み合わせて約10サンプルを高精度（CV 10%以下）に比較分析する方法を確立した。またペプチドについては2010年に報告済みの独自のペプチド抽出法（DS法）とIsobaric Tag 法を組み合わせて同様の比較分析法を確立した。(3)モデルマウス①の血漿タンパク質分析：(2)で確立した方法を、モデルマウス血①に応用し、血漿中の約700種類に由来するタンパク質を高精度に比較し、不安用行動（多動、明所存在比）に相関して変動するタンパク質を探索した。
2: おおむね順調に進展している
研究実績の概要に記載の通り、交付申請書に記載の平成26年度の研究事項はほぼ達成できた。この結果、血漿タンパク質の高精度比較分析法の確立も順調に進み、不安障害を示すピロカルピン投与マウスに関しては、血漿の比較分析から、不安様行動に伴って相関するタンパク質の分析まで進んだ。これは、当初予定していた以上に順調に進んだ部分である。一方、マウス②の血漿の採取にあたって、多少ではあるが溶血した血漿が多くなってしまった。このため、再度、マウスの準備から進める予定である。
(1)血漿タンパク質・ペプチドの詳細な比較分析：平成26年度に確立した高精度比較分析法を用いて3種類のモデルマウス①～③の血漿タンパク質・ペプチドの比較分析を行う。得られた結果から不安様行動、病態に相関の高い成分を多変量解析を用いて解析する。なお、血漿の各種前処理法を高精度に行うことは、その習得と実施において高い技術と大きな労力・時間を要する。そこで、平成27年度は、まずは①のモデルマウスについてタンパク質とペプチドの分析を行う。(2)脳内タンパク質変動解析法の確立：脳のプロテオーム解析のポイントは膜タンパク質、シナプス関連タンパク質も含めて分析することである。これに関しては、膜タンパク質の酵素消化の効率を上げる界面活性剤（Mol. Cellu. Proteomics 8: 2770-7,2009）を利用して行う。この方法と安定同位体標識法（Isobaric Tag 法）を組み合わせた網羅性の高い高精度比較分析法を確立する。(3)脳内タンパク質の変動、不安様行動と相関する血漿タンパク質・ペプチドの探索：(1), (2)の結果をもとに、不安用行動の病態（不安用行動並びに脳内タンパク質の変動、脳内ネットワークの変動）を反映する血漿タンパク質・ペプチド因子の探索を行う。
研究遂行に必要な物品を購入した結果、少し残高が生じたので、来年度使用することとした。
試薬の購入に使用する。
すべて 2015 2014
すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 6件、 オープンアクセス 4件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (5件) (うち招待講演 5件) 図書 (1件) 産業財産権 (1件)
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