| 研究課題/領域番号 |
26640117
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| 研究機関 | 国立遺伝学研究所 |
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研究代表者 |
飯田 哲史 国立遺伝学研究所, 細胞遺伝研究系, 助教 (60391851)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | リボヌクレオチド / rNMP / ゲノム / 損傷 / 定量 / 次世代シークエンサー |
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| 研究実績の概要 |
本年度の研究では、高頻度のDNA修復を誘導する内在性の損傷として、染色体中に誤って取り込まれたリボヌクレオチドに注目し、次世代シークエンサーを用いたゲノム中のリボヌクレオチド(rNMP)蓄積の網羅的定量法の確立を目指しました。
(I) 二次ライブラリーを用いたrNMPの一塩基レベル網羅的定量マッピング法：本年度は、細胞周期を厳密に制御できる出芽酵母を間期G1に停止同調した細胞を用いて条件検討を行いました。まず細胞から調製した全DNAから断片長が平均500bpの通常の次世代シークエンサー用の二本鎖DNAライブラリーを作成します。rNMPの検出では、ライブラリーをRNaseH I・H II で処理することにより、rNMPの5'側が切断され、rNMPの上流(5'側)に3'-OHを生じさせ、ニックの入った二本鎖DNA ライブラリーを熱変性により一本鎖化し、ニック由来の3'-OH に元のライブラリーとは異なるタグ配列をもつアダプターを付加してrNMPの検出用二次ライブラリーとしました。アダプター未結合の断片の末端を極力排除するため、一次ライブラリーの3'OH末端のマスキングと精製をライブラリー作成過程に取り入れ、偽陽性リードを出来るだけ減らしたライブラリー作成法の確立を行いました。予備実験によってrNMPの定量は、rNMP検出リードとコントロールリードの比によって定量性を持たせることが可能であることを確認しており、合成した既知のDNA断片を用いたライブラリーでは、ライブラリーの品質評価が可能であることを見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の研究実施進行状況はほぼ予定通りであった。実際に二次ライブラリー法によりライブラリーを作成した際、一次ライブラリー作成時点でのアダプター未結合分子の残存が定量性を大きく損なう大きな問題として浮上してきたが、一次ライブラリーの精製法の確立と残存未結合分子のマスキング法などを工夫し条件を最適化することで本年度内にライブラリー作成法の確立を完了することが出来た。本問題の解決法は、今後類似の方法で次世代シークエンサー用のライブラリーを作成する際に応用可能でライブラリー作成の基本プロトコールの１ステップとして取り入れることでスムーズな解析が可能になると期待され、本研究が順調に進んでいると判断した。また、コンピューターを使ったrNMPの解析法についても、初期に作成したライブラリーのデータをモデルに解析系を確立することにより、rNMP検出時のコントロールリードの扱い方やrNMPリードのマッピングの仕方を、ライブラリー作成のプロトコールが確定する前に検討することが出来た。本年度検討したデータ解析法により、次年度以降の解析をスムーズ行える下地が出来たことも本年度の研究実施進行状況が順調であったと判断した理由である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究推進の方策として、当初予定していた細胞周期におけるrNMP蓄積の動態解明のまえに、細胞培養条件の変化に伴うG1期におけるrNMP蓄積プロファイルの詳細を明らかにすることが重要であると考えている。rNMPの取り込みや、DNA修復の効率は、細胞増殖の状態によって大きく変わる可能性が高いと考えられる。実際に、rNMPの取り込みが変化するDNAポリメラーゼの変異体では、細胞増殖シグナルに関係する培養条件で野生型細胞とくらべて薬剤への反応が大きく異なることがわかってきた。今後細胞周期におけるrNMPの蓄積を解析する前に、培養条件によってゲノムの質がダイナミックに変化する可能性をしっかり探索することが、細胞周期におけるrNMPの動態を追う上で必要になってくる変異体の使用や培地変換に応答した変化を排除した正確なデータを得る上で重要であると考えている。具体的には、野生型株の培養条件を変化させG1期に蓄積しているrNMPのプロファイルを明らかにすること、また同様の条件でrNMPの除去修復が困難となるRNaseH2の変異体におけるrNMP蓄積のプロファイルを明らかにすることで、取込みと除去のバランスがどのように変化するのかという新しい問題の答えが得られるように研究を推進する予定である。その後、計画通り、細胞周期やrNMP除去に関わるDNA修復関連の変異体を用いた解析を遂行する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度雇用予定であった実験補助者が諸事情により雇用辞退したため、人件費を価格改定により価格が上昇した次世代シークエンサー用試薬(物品費)へ適切に流用した。また、所属変更に伴う研究室の引越しが重なり予定していた次世代シークエンサーライブラリー作成用の合成DNAの発注が出来なかったため、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額分は、解析に必須な価格改定によって上昇した次世代シークエンサー用試薬購入費と(物品費)、本年度購入研究室異動により見送った合成DNAの購入費として適正に使用する予定である。
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| 備考 |
(1)本研究遂行の過程で作成した、次世代シークエンサーデータ解析用Webツールのホームページ
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