| 研究課題/領域番号 |
26640120
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
|---|
研究代表者 |
笹川 洋平 国立研究開発法人理化学研究所, 情報基盤センター, 上級センター研究員 (10404344)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| キーワード | 1細胞 / マルチオミックス |
|---|
| 研究実績の概要 |
ゲノムDNAのクロマチン構造やメチル化の変化などエピゲノム状態の変化が及ぼすRNA量への影響は未だに理解されていない部分が多い。1細胞から両者の情報を同時に測ることでより詳細な解析が可能となり転写の深い理解につながると期待される。
本申請課題では転写産物量（蓄積したRNA量）とエピゲノム情報（クロマチン構造などのDNA情報）を1細胞から同時に測定するため、以下2つのパートに分けて技術開発を推進している。エピゲノム情報やRNA情報をとらえる検出技術の開発と、エピゲノム情報とRNA情報を分離／分画する技術の開発である。今年度は各々で下記内容を研究し、同時測定のための技術にむけて前進した。
[検出技術] エピゲノム状態を計測するには、断片化したdsDNAを高効率でシーケンスライブラリDNAに変換する必要が有る。前年度は数十%のレベルであったが、約50-80%まで上昇させることができた。
[分離・分画技術] 2つの情報を同時に測定するためには、エピゲノムとRNAを物理的に分画する方式と、分子生物学的に2つを分ける方式が考えられる。本年度は前者に対して必要な、核抽出条件の確立、高精度な精製magnetic plate 384wellの開発、384well用分注装置の厳密な設定を行った。また前年度に引き続き、分子生物学的な分離の中心技術としてIndex配列をRNAにつける方式を引き続き開発を続けた。特にIndexの配列を研究連携者團野博士に協力してもらい、シーケンスレーベンシュタイン距離を考慮した12merの配列を持つ96種類の配列を計算・合成した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本申請課題では転写産物量とエピゲノム情報を1細胞から同時に測定するため、以下2つのパートに分けて技術開発を推進している。エピゲノム情報やRNA情報をとらえる検出技術の開発と、エピゲノム情報とRNA情報を分離／分画する技術の開発である。
メチル化DNAとRNAの1細胞での同時測定に関しては、同課題進行中に論文が報告された。一方で、クロマチン構造とRNA量の同時測定は未だ達成されていない。本研究課題のなかの提案で、より報告の価値が高い後者の開発に専念することとした。方針の変更等のためにやや進行に遅れを感じられる。エピゲノムを捉えるために重要な、DNA捕捉効率は今年度の開発で、約50-80%まで上昇させることができた。1細胞レベルでのライブラリ作製を行う場合、ISO class6-7の通常実験室環境では空気中由来のDNAのコンタミネーション問題が有り、トラブルシュートのため問題を精査した。結果、ISO class 1クリーベンチによる調整で防ぐことが出来るのがわかり1細胞でのエピゲノム情報の取得での問題を減らすことが出来た。
[分離・分画技術] 2つの情報を同時に測定するためには、エピゲノムとRNAを物理的に分画する方式と、分子生物学的に2つを分ける方式が考えられる。後者の分子生物学的に分ける手法は、世界的に見ても報告が殆ど無く、開発の価値が高いと思われる。分離の中心技術としてIndex配列をRNAにつける方式を引き続き開発を続けた。新生RNAを含むnon-poly-A RNAの検出に関しては、前年度にある程度うまく行っており、Index配列をつけたオリゴを使うことで、情報科学的にあとで分離できるため同時測定が可能になると期待される。本技術は、よりハイスループットに全長RNAの情報を取得できる技術にもつながり、派生ではあるが1細胞RNA-seqにとっても重要な技術になると期待される。
|
| 今後の研究の推進方策 |
1細胞からの核酸の同時測定技術は、本研究課題推進中に何件か報告された。ゲノムDNA配列とRNA量もしくはDNAメチル化とRNA量を1細胞で計測できることが達成された。一方で、クロマチン構造とRNA量の同時測定は未だ達成されていない。本研究課題のなかの提案で、より報告の価値が高い後者の開発に専念することとした。また世界的な現状、分子生物学的な中心となる同時測定技術はほとんど報告されていない。同時測定には物理的な分画が主流である。分子生物学的な分離技術は、様々な1細胞デバイスでの実装がかのうであるためよりインパクトが高いと考えられる。その中心技術が、RNAの全長Index化とエピゲノム情報の同時測定である。また全長RNA配列が検出できる超ハイスループット1細胞RNA-seqはだれも達成できておらず求められている技術である。目的外ではあるが、RNAの全長Index化は、上記インパクトも併せ持っている本技術を中心に技術開発し目的を果たしたい。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
次世代シーケンス試薬と関連試薬を購入予定であったが、次世代シーケンスによる方法の検証の計画に遅れが生じたため、試薬の劣化を防ぐために、当該年度に購入しなかったため。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
次年度は予定されていた次世代シーケンスによる方法の検証を進めるために主に、次世代シーケンス試薬と関連試薬の購入に使用する予定である。
|
