研究課題
本研究の目的は、申請者らが発見した摂食亢進ホルモンのグレリンを対象として、その受容体を活性化するモノクローナル抗体を作製し、活性型グレリン受容体の結晶構造解析のツールとして使うことである。グレリン受容体は熱安定性が弱く、そのままでは結晶化が困難である。そこでグレリン受容体にT４リゾチームやbRILタンパクとの融合体にすることや、受容体のアミノ酸を置換して熱安定性を高めるとともに、受容体抗体を作製して、この抗体を結晶化の共タンパク質とすることを計画した。昆虫細胞で合成したグレリン受容体タンパク質をマウスに免役し、定法に従ってモノクローナル抗体を作製した。グレリン受容体リポソームへの結合チェックによって、グレリン受容体に対する2種類の立体構造認識モノクローナル抗体が得られた。この2種類の抗体は、ひとつは細胞内認識、もうひとつは細胞外認識であった。現在、その認識部位などをチェック中である。予備的な検討では、結晶化の際にこれらの抗体を加えることで、熱安定性に変化があることを確認した。またグレリン受容体に対するモノクローナル抗体とともに、グレリン受容体に対するアルパカ・ナノボディの作成も進めた。グレリン受容体を無細胞系で発現させ、リポソームに組み込み、これを抗原としてアルパカに免疫した。このアルパカからリンパ球を採取し、mRNAを分離した。ナノボディをコードするIgG、すなわち重鎖一本鎖抗体のIgG2とIgG3をPCRで増幅し、抗原認識部位のcDNAを得た。これを発現ベクターに組み込み、ファージに発現させ、ファージディスプレイ・ライブラリを構築した。現在このライブラリからパンニング操作によって、グレリン受容体を認識するナノボディをスクリーニング中である。
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