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2014 年度 実施状況報告書

ハイブリッド光検出器を使った高速度一分子蛍光観察法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 26650045
研究機関東北大学

研究代表者

高橋 聡  東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (30283641)

研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2016-03-31
キーワードラインフォーカス型共焦点顕微鏡 / 一分子蛍光観察 / ハイブリッド型フォトダイオード / 石英製顕微対物レンズ
研究実績の概要

1)ラインフォーカス型共焦点顕微鏡を用いた一分子蛍光観察装置の深化:ラインフォーカス型一分子の蛍光観察装置を用いて、タンパク質のフォールディング運動を観察した。プロテインAのBドメインについて、二つのラベル化試料を一分子観察し、サブミリ秒の時間領域で揺らぎ運動を行うことを見いだした。さらに、量子収率の補正方法等、一分子観察実験を行うための数々のノウハウを蓄積した。
2)ハイブリッド型フォトダイオード(HPD)とラインフォーカス型共焦点顕微鏡を組み合わせた高時間分解能一分子観測装置の開発:HPDを用いることで、一分子蛍光観察実験の時間分解能を劇的に向上できる可能性がある。実際にHPDを装置に組み込んだところ、10マイクロ秒の時間分解能で10ミリ秒程度の観測時間にて一分子蛍光観察が可能になった。これは、我々の従来の装置の一桁以上の時間分解能の向上と観測時間の数倍の向上に対応する。本装置を用いてプロテインAのBドメインの計測を行ったところ、変性状態の中に多数の副状態が存在し、副状態間の遷移をおこしながら揺らぐ様子が観察された。
3)石英製顕微対物レンズを用いた共焦点顕微鏡の背景光の低下:開発した装置は、劇的な時間分解能の向上が期待できることが示されたが、ライン共焦点顕微鏡特有の問題として、背景光が強いことが問題であることがわかった。また、背景光の主要因が顕微レンズによる自家蛍光であることがわかった。そのため、自家蛍光が少ない石英製顕微レンズを用いて背景光の低下を図った。メーカーのデモ品を用いたテストでは、従来の顕微レンズを使った場合に比べて、背景光が数分の一に低下することがわかった。これにより、さらに装置の時間分解能の向上が期待できる。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

上記に説明した通り、本研究は想定以上の進展を示している。特に、石英製顕微対物レンズを用いることで、装置の背景光レベルを低下させることで、驚くほどのデータの質の向上が図られた。これは想定しなかった進展であり、注意深い実験の工夫から生まれたものである。

今後の研究の推進方策

次年度は、石英製顕微対物レンズを用いたシステムによるデータ取得に集中して取り組み、装置のデモンストレーションとしての論文化を目指す。さらに、高繰り返しピコ秒パルスレーザーと組み合わせることで、蛍光フォトンを一個づつ時分割計測し、一分子レベルで蛍光寿命測定を行う実験を可能にする。また、装置を用いた蛍光相関測定を可能にする。

  • 研究成果

    (10件)

すべて 2015 2014

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (9件) (うち招待講演 3件)

  • [雑誌論文] マイクロ秒分解一分子蛍光測定で観るタンパク質の構造変化2014

    • 著者名/発表者名
      小井川浩之, 齊藤雅嵩, 高橋聡
    • 雑誌名

      生物物理

      巻: 54 ページ: 276-279

    • DOI

      10.2142/biophys.54.276

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] Development of The Line Confocal System for The Single Molecule Tracking of Folding Dynamics of Proteins2015

    • 著者名/発表者名
      Hiroyuki Oikawa , Kiyoto Kamagata, Munehito Arai, Atuhito Fukasawa, Hiroaki Yokota, Toru Ide, Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      Biophysical Society 59th Annual Meeting
    • 発表場所
      Baltimore, USA
    • 年月日
      2015-02-07 – 2015-02-11
  • [学会発表] Dynamics of Protein Folding Studied by Single Molecule Fluorescence Time Series Measurements at Microsecond Resolution2014

    • 著者名/発表者名
      Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      Indo-Japan Joint Workshop on "Frontiers in Molecular Spectroscopy: Fundamentals and Applications to Material and Biology"
    • 発表場所
      Nara
    • 年月日
      2014-11-25 – 2014-11-28
    • 招待講演
  • [学会発表] Development of the line confocal system for the single molecule tracking of fast folding dynamics of proteins2014

    • 著者名/発表者名
      Hiroyuki Oikawa Kiyoto Kamagata, Munehito Arai, Atsuhito Fukasawa, Hiroaki Yokota, Toru Ide, Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      第52回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      北海道札幌市
    • 年月日
      2014-09-25 – 2014-09-27
  • [学会発表] Folding dynamics of ubiquitin after rapid mixing detected by single molecule fluorescence spectroscopy2014

    • 著者名/発表者名
      Masataka Saito, Chen Erick, Chen Po-Ting, Chen Rita P.-Y., Kiyoto Kamagata, Hiroyuki Oikawa, Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      第52回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      北海道札幌市
    • 年月日
      2014-09-25 – 2014-09-27
  • [学会発表] Continuous tracking of protein folding at microsecond resolution by a line confocal detection of single molecule fluorescence2014

    • 著者名/発表者名
      Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      The 28th Annual Symposium of The Protein Society
    • 発表場所
      San Diego, USA
    • 年月日
      2014-07-27 – 2014-07-30
    • 招待講演
  • [学会発表] Development of the line confocal system for the single-molecule tracking of the protein folding transition2014

    • 著者名/発表者名
      Hiroyuki Oikawa
    • 学会等名
      International Workshop "Over the Barriers of Transition Paths: Dynamical Processes in Proteins and Complex Molecular Systems"
    • 発表場所
      Yokohama, Japan
    • 年月日
      2014-06-28 – 2014-06-28
    • 招待講演
  • [学会発表] 一分子蛍光分光法によるユビキチンの折り畳みダイナミクス2014

    • 著者名/発表者名
      齊藤雅嵩・Chen Hsin-Liang・Chen Po-Ting・Chen Rita P.-Y.・鎌形清人・小井川浩之・高橋聡
    • 学会等名
      第14回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      神奈川県横浜市
    • 年月日
      2014-06-25 – 2014-06-27
  • [学会発表] 改良したマイクロ秒分解一分子蛍光測定法による蛋白質の高速折り畳みダイナミクスの追跡2014

    • 著者名/発表者名
      小井川浩之・鎌形清人・ 新井宗仁・ 深澤宏仁・横田浩章・井出徹・高橋聡
    • 学会等名
      第14回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      神奈川県横浜市
    • 年月日
      2014-06-25 – 2014-06-27
  • [学会発表] Microsecond-dynamics of the unfolded BdpA and ubiquitin by a line confocal detection of single molecule fluorescence2014

    • 著者名/発表者名
      Hiroyuki Oikawa , Masataka Saito, Po-Ting Chen, Hsin-Liang Chen, Rita P.-Y. Chen, Munehito Arai, Kiyoto Kamagata, Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      The 4th Asia Pacific Protein Association Conference
    • 発表場所
      Jeju, Korea
    • 年月日
      2014-06-17 – 2014-06-20

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公開日: 2016-05-27  

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