| 研究課題/領域番号 |
26650057
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| 研究機関 | 浜松ホトニクス株式会社 |
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研究代表者 |
木村 祐史 浜松ホトニクス株式会社, 中央研究所, 部員 (90713371)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 生体膜 / 呼吸鎖複合体I / イオン駆動型モーター |
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| 研究実績の概要 |
FoF1-ATP合成酵素は、生体膜内外のプロトン濃度・電位勾配により作り出される電気化学ポテンシャルをエネルギー源としてATPを合成する、イオン駆動型回転分子モーターである。本研究では、この電気化学ポテンシャルを光により創出し、従来不可能であったFoF1-ATP合成酵素の光による人為的な駆動に挑戦する。この目標を達成するために、研究期間内にFoF1の回転運動の計測を可能にする系を構築する必要がある。そこで、平成26年度は、本研究で必要となるマイクロデバイスや光学系等からなる測定・操作システムの開発・構築を行った。
本研究に用いるデバイスは2つの流路を持ち、流路の間が壁で仕切られている。壁が薄くなっているところに微細小孔（～2 μm）を持つ。このデバイスの動作を評価するために、次のように、巨大化大腸菌の膜に存在する呼吸鎖複合体Iの機能イメージングを行った。まず、ペニシリン系抗生物質により得られた巨大化大腸菌を微細小孔に捕捉・固定した。次に、直流パルスにより微細小孔部にて膜を穿孔することで、大腸菌内部側にあるNADH（複合体Iの駆動剤）結合部位にアクセスすることを可能とした。その後、流路内を蛍光性pH指示薬で満たし、巨大化大腸菌内部とつながっている側の流路へNADHを導入した。すると、もう一方の流路で、蛍光性pH指示薬が明るくなる様子が観察できた。これは、複合体Iが膜を超えてプロトンを大量に輸送したことを示唆している。以上のように、本デバイスは生体膜に挿入されている膜タンパク質の機能をリアルタイムで測定することができる。また、光による駆動に必要な光学系として、エバネッセント照明の導入を行い、顕微鏡観察領域への入射を確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
計画通りに、マイクロデバイスと巨大生体膜リポソームを融合した測定システムを構築し、膜上に存在する膜タンパク質、呼吸鎖複合体Iの機能イメージングに成功することで、測定システムの有効性を実証した。次年度においては、FoF1-ATP合成酵素の機能イメージングを行うことが課題となる。また、光駆動に必要となるエバネッセント照明光学系を構築し、現在は購入したレーザーの波長（1064 nm）に適した全反射条件の検討をしている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成26年度に構築した測定システムを用いて、FoF1-ATP合成酵素の機能イメージングを行う。まずATP駆動によるFoF1-ATP合成酵素のプロトン輸送活性のイメージングに取り組むことで活性を保持していることを確認した後に、FoF1の回転運動の計測を行う。また、最終年度に備え、今年度中に1064 nmのレーザー光によるエバネッセント照明を確立する。
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