| 研究課題/領域番号 |
26650064
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| 研究機関 | 兵庫県立大学 |
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研究代表者 |
西谷 秀男 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (40253455)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | タンパク質 / 細胞周期 / スピンドル / DNA |
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| 研究実績の概要 |
細胞周期の過程において遺伝情報を正確に継承するため、染色体の複製と分配が正確に行なわれる。Cdt1は染色体複製のライセンス化因子として複製の開始に関わる必須因子である。再複製の抑制のためS期開始後分解されるが、M期から再び安定に存在し始め、染色体分配にも関わりM期とS期を共役する重要な機能を持つと考え研究を行っている。
１、まず、M期に安定化する機構の解析を進め、S期およびM期に同調した細胞をMG132 で処理して、Cdt1およびサイクリンAを十分に蓄積させた条件下での結合を調べた。この条件下でもM期Cdt1は、S期Cdt1より、サイクリンAとの結合が低下していることが認められた。また、SCF-Skp2のターゲットであるp27はM期で分解されるがCdt1は分解されないのは、M期ではサイクリンAの状態がS期とは異なっている可能性があり、FLAGタグを付けたCdt1およびp27を調整し、S期およびM期抽出液と混合してサイクリンAの結合を比較した。サイクリンA結合部位であるCyモチーフ(RxL)周辺のアミノ酸配列は、p27がPsAcRnLfgpVD、Cdt1はPpArRrLrlsVDでよく保存されている。両タンパク質とも、M期抽出液サイクリンAとの結合能が低下し、p27の方がCdt1より結合が強い傾向が見られた。
２、M期でのCdt1の機能を明らかにするため、FLAG-Cdt1を精製し、質量分析によりM期Cdt1結合因子を調べている。酵母２ハイブリッドスクリーニングで得られたクローンも含めて、スピンドル形成に関わる因子を候補として、Cdt1との結合を調べた。現在、有意な結合は見られておらず、今後、FLAG-Cdt1を高発現して調べる予定である。
３、Cdt1のM期での機能をライブイメージングにより調べるため、GFP-チューブリンを安定に発現するHeLa株およびU2OS株を構築した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
M期でCdt1がユビキチンリガーゼSCF-Skp2に認識されず安定化するのは、サイクリン-CDKによる認識に必要なリン酸化を受けないからと考えて研究を進めている。M期にCdt1とサイクリンとの結合が低下しているのは、Cdt1の別の部位のリン酸化が関与しているデータに加えて、M期のサイクリンAは基質との結合が低下することも寄与する新たな結果が得られてきている。また、イメージングにより解析に必要な細胞株の作成も進んでいる。ただし、Cdt1と結合する新規因子の解析には工夫が必要である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究を次のように計画する。
１、M期のCdt1とサイクリンAとの結合能が低下していることを、これまで抽出液をもとに行なってきたが、さらに他の因子の関与を除くため、抽出液から粗精製したタンパク質を用いて確認する。
２、質量分析、あるいは酵母２ハイブリッドスクリーニングで得られたCdt1結合候補因子との結合を調べる。これまでの結果より、Cdt1と結合している画分は少ない、あるいは結合能は弱いと思われるので、FLAG-Cdt1を導入して高発現させM期に同調した細胞からプルダウンして解析する。
３、GFP-チューブリン発現細胞を用いて、Cdt1をノックダウンしてM期進行の様子、M期進行中におけるスピンドル形成をライブイメージングで解析する。また、Cdt1のM期安定化に関わるジェミニンのノックダウンでも同様に解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該実験を行なうにあたり、大学からの講座費により購入した試薬・培地等を使用したため，それに対応する分、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本年度の助成金と合わせて研究の遂行に必要な物品の購入および成果の発表に充て、適正に使用する。
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