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2014 年度 実施状況報告書

生きた個体を用いて脳形成における神経細胞産生の時間的空間的制御機構を解明する

研究課題

研究課題/領域番号 26650077
研究機関京都大学

研究代表者

瀬原 淳子  京都大学, 再生医科学研究所, 教授 (60209038)

研究分担者 佐藤 文規  京都大学, 健康長寿社会の総合医療開発ユニット, 特定助教 (10588263)
研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2016-03-31
キーワード細胞分化 / 増殖因子 / 神経分化 / ゼブラフィッシュ / ライブイメージング / ニューレグリン / ErbB
研究実績の概要

脳の発達において、神経前駆細胞(NPC)は増殖し神経を産みだす。NPCの増殖の程度や神経産生のタイミングの制御が、脳の大きさや形の重要な要因となるが、そこに細胞外シグナリングが関与するのかどうか、それともどれだけ増殖して分化するかは、もっぱら神経細胞自律的に決まっているのか、このことは、このプロセスに関与する細胞外シグナルが同定されておらず、不明であった。本研究において我々は、脊椎動物の脳形成機構を探るため、ゼブラフィッシュ中脳視覚統合領域である視蓋の形成をモデルとして、この問題に取り組んだ。神経幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞を可視化することによって、生きた胚の脳では、受精後ほぼ決まった時間に脳の基底側(外側)から細胞分裂を終えた神経細胞の産生が始まり、そこから脳室側(内側)に向けて産生された脳細胞が蓄積していくことを見いだした。さらに、神経前駆細胞のイメージングを繰り返し行うことにより、神経前駆細胞には、ふたつの分裂様式があることを見出した。ひとつは基底側・脳室側間でのエレベーター運動の後に脳室側で分裂するタイプ、もう一つは基底側の神経層の近傍sub-basal領域にあって、移動を伴わずに分裂するタイプである。後者の分裂だけが、神経細胞の産生につながること、そしてその産生がErbBシグナルに依存することを明らかにした。そして一過的に胚をErbBインヒビター処理することにより、sub-basal領域におけるNPCからの神経細胞の産生に、ErbBシグナルが直接的に関与することを示した。ErbBリガンドのNRG1 TypeIIのノックダウンにより神経細胞産生の抑制され、それはヒト 可溶型NRGを脳に注入することによって、ある程度回復させることができた。これらのことから、脊椎動物の脳発生における神経分化に、 NRG1-ErbBシグナリングが関与することが明らかになった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

我々は本研究において、ゼブラフィッシュの中脳視蓋を可視化することにより、神経細胞が個体の中でどのように分化・産生されるのかを検討し、それが、 きわめて規則的に、subbasal側で産生されることを示した。そしてほぼ計画通り実験を進めることができ、 ErbBシグナルインヒビターと アンチセンスモルフォリーノを組み合わせることにより、ニューレグリンーErbBシグナリングに依存して神経前駆細胞から神経細胞が産生されることを示すことができた。ここまでの結果を論文投稿中である。

今後の研究の推進方策

上記のように、これまでは、関与する遺伝子を示すのに、それらの遺伝子のアンチセンスモルフォリーノやドミナントネガティブフォームの発現、インヒビターなどを使用してきた。しかし最近、criper-cas9システムを用いてノックアウトゼブラフィッシュの作成が可能となり、我々の研究室でもその系を立ち上げることができた。そこで、今後は、ニューレグリン遺伝子のノックアウトゼブラフィッシュを作成して、その役割をさらに検討したい。また、ニューレグリンは膜型の増殖因子で、プロテアーゼによる切断制御を受けていることが示唆されている。そこで、それらのプロテアーゼの関与を示すことを計画している

次年度使用額が生じた理由

従来小型魚類を用いた研究では、遺伝子を アンチセンスモルフォリーノなどを用いた遺伝子発現抑制により解析してきた。昨年度繰越したのは、 最近確立されたcrisper-cas9システムを導入し、遺伝子の解析を遺伝子変異体の作成によって検討するという、より信頼性の高い実験系を取り入れたことにある。遺伝子ノックアウトゼブラフィッシュを得るには世代を越えてこれらの掛け合せをする必要があり、当初計画していた研究内容を今年度に繰り越して行う必要があった。結果として、現在6種類の ADAM プロテアーゼ欠損ゼブラフィッシュや増殖因子欠損ゼブラフィッシュの作成に成功または作成中である。本プロジェクトは、これによってより確実で、再現性の高い研究結果が得られる手段を得たことになる。
27年度はこれらを利用して、独創性の高い研究成果を目指すものである。

次年度使用額の使用計画

上述のように、繰り越した経費を用いて、ADAM プロテアーゼ欠損ゼブラフィッシュ・増殖因子欠損ゼブラフィッシュの作成・掛け合せ・解析を予定している。

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2014

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (5件) (うち招待講演 5件)

  • [雑誌論文] miR-195/497 induce postnatal quiescence of skeletal muscle stem cells2014

    • 著者名/発表者名
      Sato, T., Yamamoto, T., Sehara-Fujisawa, A..
    • 雑誌名

      Nat. Commun

      巻: 5 ページ: 4597

    • DOI

      10.1038/ncomms5597

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] Mechanisms of Skeletal Muscle Regeneration2014

    • 著者名/発表者名
      Atsuko Sehara-Fujisawa
    • 学会等名
      Symposium “Genomic and epigenomic insights into vertebrate regeneration, development and evolustion - development and evolution - Xenopus and fish as models”
    • 発表場所
      Pontificia Universidad Catolica de Chile(チリ・カトリカ大学)
    • 年月日
      2014-11-05
    • 招待講演
  • [学会発表] Novel Molecular and Cellular Mechanisms of Skeletal Muscle Regeneration2014

    • 著者名/発表者名
      Atsuko Sehara-Fujisawa
    • 学会等名
      KEY Forum: From Stem Cells to Organs  熊本医学・生物科学国際シンポジウム「幹細胞制御と臓器再建」
    • 発表場所
      熊本市医師会館(熊本県熊本市)
    • 年月日
      2014-09-05
    • 招待講演
  • [学会発表] Mechanisms of Skeletal Muscle Regeneration2014

    • 著者名/発表者名
      Atsuko Sehara-Fujisawa
    • 学会等名
      The 2nd Kyoto University & National Taiwan University Symposium 2014 -Biology-
    • 発表場所
      京都大学(京都府京都市)
    • 年月日
      2014-09-01
    • 招待講演
  • [学会発表] Exploring Mechanisms of Neurogenesis in the Developing Brain with Live Zebrafish Embryos2014

    • 著者名/発表者名
      Tomomi Sato, Fuminori Sato, Aosa Kamezaki, Koichi Kawakami, Atsuko Sehara-Fujisawa
    • 学会等名
      第66回日本細胞生物学会大会 シンポジウム7「細胞生物学における小型魚類の魅力」
    • 発表場所
      奈良県新公会堂(奈良県奈良市)
    • 年月日
      2014-06-12
    • 招待講演
  • [学会発表] 神経細胞分化を制御する脳内細胞外環境2014

    • 著者名/発表者名
      瀬原淳子
    • 学会等名
      第14回日本抗加齢医学会総会 Basic Science 4「抗加齢をめざす、細胞外環境による幹細胞維持・分化制御の探索」
    • 発表場所
      大阪国際会議場(大阪府大阪市)
    • 年月日
      2014-06-08
    • 招待講演

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公開日: 2016-05-27  

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