新規モデル脊索動物としてのオタマボヤを用いた順遺伝学的スクリーニング法の開発

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26650079
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 西田 宏記 大阪大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (60192689)
• 研究分担者: 小沼 健 大阪大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (30632103)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: オタマボヤ / 尾虫類 / トランスジェニック / エンハンサートラップ / 変異体形成 / DNAi / トランスポゾン

研究実績の概要

ワカレオタマボヤ Oikopleura dioicaは成体でもオタマジャクシ型をしており、我々ヒトを含む脊索動物に共通な体制を持ちながら、体を構成する細胞数が少なく、5日という短い世代時間をもつなど、他の脊索動物にない多くの特性を備えている。本研究では、このオタマボヤにトランスポゾンをもちいた技術を適用し、発生遺伝学的な研究を可能にすることを目的とした。
ワカレオタマボヤで転移活性をもつトランスポゾンを調べた。オタマボヤでは、蛍光タンパクのmRNAを卵巣に注入することにより生まれてきた多数の卵や胚に蛍光タンパクが発現してくる。そこで、転移酵素の発現を調べるため、EGFP標識した転移酵素トランスポゼース7種 (Sleeping beauty, Minos, Tol2, piggyBac, Ac/DS, Space invador, TcBuster) のmRNAを卵巣に注入した。注入胚を蛍光顕微鏡で観察し、蛍光の有無を調べたところ、どれも充分な蛍光を観察することができなかった。現在、その原因を究明中である。
また、上記のように卵巣顕微注入法をもちいて卵形成過程の卵巣内にDNAやRNAを取り込ませることが可能となっている。このような利点をから、遺伝子機能を阻害する為のDNAi法を確立した。DNAi法は、細胞内に二重鎖DNAを取り込ませることにより、この取り込んだDNAの配列に基づき配列特異な機能阻害が引き起こされるという現象である。これまでに、ワカレオタマボヤにおいて二重鎖DNAを細胞内に取り込ませることで配列特異な転写阻害およびmRNAの分解が引き起こされるということを、多細胞動物で初めて発見した。このDNAiの発見により卵巣内にPCR断片を注入するだけで配列特異な機能阻害が可能となったことから容易に遺伝子機能が解析可能となった。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

導入したトランスポゼースの翻訳効率を調べるために、EGFP標識した転移酵素トランスポゼース7種 (Sleeping beauty, Minos, Tol2, piggyBac, Ac/DS, Space invador, TcBuster) のmRNAを卵巣に注入した。注入胚を蛍光顕微鏡で観察し、蛍光の有無を調べたところ、どれも充分な蛍光を観察することができなかった。また、おそらくこのことが原因で、トランスポゾンをゲノムに導入することに未だ成功していない。オタマボヤの生殖巣や胚にはトランスポゼースmRNAの翻訳を阻害する仕組みが存在している可能性がある。また、オタマボヤの内在性母性mRNAには、高頻度でトランススプライシングのリーダー配列がついていることがわかったので、このリーダー配列が効率的な翻訳に関わっている可能性がある。

今後の研究の推進方策

RNAseqを行った結果、オタマボヤの内在性母性mRNAには、高頻度でトランススプライシングのリーダー配列がついていることがわかったので、このリーダー配列が効率的な翻訳に関わっている可能性がある。そこで、注入するEGFP標識した転移酵素トランスポゼースのmRNAに様々な形でこのリーダー配列を付加し、翻訳効率を検討する。もし、効率的な翻訳が確認された場合、トランスポゾンをゲノムに導入することを試み、トランスジェニック個体の作成、エンハンサートラップへと実験を進める予定である。

次年度使用額が生じた理由

32,464円が次年度使用額として生じた。少額ではあるが、当初予定よりは研究費が節約できたため次年度に使用することにした

次年度使用額の使用計画

32,464円の次年度使用額を、薬品類購入額として使用する。

研究成果

• [雑誌論文] Guidelines for the nomenclature of genetic elements in tunicate genomes. (2015)
  • 著者名/発表者名: Stolfi, A., Sasakura, Y., Chalopin, D., Satou, Y., Christiaen, L., Dantec, C., Endo, T., Naville, M., Nishida, H., Swalla, B., Volff, J-N., Voskoboynik, A., Dauga, D., and Lemaire, P.
  • 雑誌名: Genesis 巻: 53 ページ: 1-14
  • DOI: 10.1002/dvg.22822
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] REGULATOR: a database of metazoan transcription factors and maternal factors for developmental studies. (2015)
  • 著者名/発表者名: Wang, K., and Nishida, H.
  • 雑誌名: BMC Bioinformatics 巻: 16 ページ: 114
  • DOI: 10.1186/s12859-015-0552-x
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] DNA interference: DNA-induced gene silencing in the appendicularian Oikopleura dioica. (2015)
  • 著者名/発表者名: Omotezako, T., Onuma, T. A., and Nishida, H.
  • 雑誌名: Proc. R. Soc. B 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Regulation of the number of cell division rounds by tissue-specific transcription factors and Cdk inhibitor during ascidian embryogenesis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kuwajima, M., Kumano, G., and Nishida, H.
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 9 ページ: e90188
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0090188
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Transcription factor Tbx6 plays a central role in fate determination between mesenchyme and muscle in embryos of the ascidian, Halocynthia roretzi. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kumano, G., Negoro, N., and Nishida, H.
  • 雑誌名: Dev. Growth Differ. 巻: 56 ページ: 310-322
  • DOI: 10.1111/dgd.12133
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Control of the number of cell division rounds in distinct tissues during ascidian embryogenesis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yamada, A., and Nishida, H.
  • 雑誌名: Dev. Growth Differ. 巻: 56 ページ: 376-386
  • DOI: 10.1111/dgd.12141
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Cell lineages and fate maps in tunicates: Conservation and modification (2014)
  • 著者名/発表者名: Nishida, H., and Stach, T.
  • 雑誌名: Zool. Sci. 巻: 31 ページ: 645-652
  • DOI: 10.2108/zs140117
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Long-distance cell migration during larval development in the appendicularian, Oikopleura dioica. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kishi, K., Onuma, T. A., and Nishida, H.
  • 雑誌名: Dev. Biol. 巻: 395 ページ: 299-306
  • DOI: 10.1016/j.ydbio.2014.09.006
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] RNA interference and DNA interference: Two gene silencing systems in the appendicularian Oikopleura dioica (2014)
  • 著者名/発表者名: 表迫竜也、小沼健、西田宏記
  • 学会等名: 日本分子生物学会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（横浜）
  • 年月日: 2014-11-26
• [学会発表] オタマボヤを用いた発生額研究の近況 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小沼健、表迫竜也、岸香苗、西田宏記
  • 学会等名: ホヤ研究会
  • 発表場所: 筑波大学東京キャンパス（東京）
  • 年月日: 2014-10-13
• [学会発表] ワカレオタマボヤ幼生期における三種の長距離移動細胞の移動メカニズム (2014)
  • 著者名/発表者名: 岸香苗、小沼健、西田宏記
  • 学会等名: 日本動物学会
  • 発表場所: 東北大学川内北キャンパス（仙台）
  • 年月日: 2014-09-11
• [学会発表] 脊索動物ワカレオタマボヤの左右非対称性の形成:２細胞期胚の左右割球の標識追跡 (2014)
  • 著者名/発表者名: 林桃子、小沼健、西田宏記
  • 学会等名: 日本動物学会
  • 発表場所: 東北大学川内北キャンパス（仙台）
  • 年月日: 2014-09-11
• [学会発表] 脊索動物ワカレオタマボヤの走査型電子顕微鏡による観察 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小沼健、磯部美穂、西田宏記
  • 学会等名: 日本動物学会
  • 発表場所: 東北大学川内北キャンパス（仙台）
  • 年月日: 2014-09-11
• [備考] 西田研究室ホームページ
  • URL: http://www.bio.sci.osaka-u.ac.jp/bio_web/lab_page/nishida/index.html