| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、葉緑体内の代謝が「酵素の基質特異性」だけでなく、「酵素の局在」によっても制御されている、という考え方に基づき、葉緑体内のイソプレノイド代謝の局在について、研究を進めることにある。特に、イソプレノイド代謝において、重要な分岐点に位置するgeranylgeranyl-diphosphate (GGDP) およびphytyl-diphosphate (PDP) の定量方法を開発し、これらの基質がそれぞれ包膜、チラコイド膜に局在しているという仮説を実証することを目指す。
まず、GGDPおよびPDPの定量のため、geranylgeranyl transferase (GGT) によって、GGDPおよびPDPを蛍光色素に結合し、この蛍光色素をHPLCで検出する方法を試した。この方法で、in vitroでGGDPを検出できることは確認できたが、PDPは蛍光色素に結合しなかったために検出できなかった。また、葉緑体の膜画分においても、GGDPを検出することができたが、葉緑体の膜画分からは多数の蛍光物質が検出されたために、GGTだけはなく、chlorophyll synthaseによって、chlorophyllideにGGDPおよびPDPを結合させる方法を試すことにした。
chlorophyll synthaseを大腸菌で発現させることを試みたが、発現させることはできなかった。そこで、昆虫培養細胞を利用したbaculovirus expression systemを試みたが、活性のあるchlorophyll synthaseを発現させることはできなかった。また、in vitro transcription, translationであるmembrane max expression systemでも、活性型のchlorophyll synthaseを発現することはできなかった。
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