| 研究課題/領域番号 |
26660063
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
白石 英秋 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (90202118)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | シアノバクテリア / ギ酸 / ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 |
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| 研究実績の概要 |
moaDはモリブデン補因子の生合成経路に働く遺伝子である。モリブデン補因子は細胞内で、ギ酸脱水素酵素などの種々の酵素の補因子として働いているため、moaD変異があってモリブデン補因子が細胞内で作られないと、ギ酸脱水素酵素を初めとする種々の酵素活性に欠損を生じる。ギ酸脱水素酵素の活性発現を指標とするプレート・アッセイ法で大腸菌のmoaD変異体のギ酸脱水素活性欠損表現型を相補するクローンの単離を行ったところ、moaD遺伝子に特徴的な構造を持つ遺伝子ではなく、NAD+/NADP+ 結合モチーフを持つタンパク質の遺伝子が単離されてきたことから、これがモリブデン補因子に依存しない新規のギ酸脱水素酵素であると考えられた。藍藻のアルカン生合成系はNADPHを消費してアルカンとギ酸を生成することから、このギ酸脱水素酵素と考えられる酵素がアルカン生合成と関わりがあることが推測された。この単離された遺伝子の産物を大腸菌で大量発現させ、酵素活性を調べたところ、NADP+ からNADPHを生成する活性が見出された。この反応の基質依存性をさらに詳細に検討したところ、当初の予想に反してこの反応はギ酸の非存在下でも起き、試験管内でギ酸に対する依存性を検出することができなかった。ギ酸脱水素酵素の遺伝子ではない可能性が出て来たため、moaD変異を相補する遺伝子の再単離を試みた。大腸菌のmoaD突然変異体にArthrospira platensis のゲノム・ライブラリーを導入し、プレート・アッセイ法でギ酸脱水素酵素の活性を回復させていると考えられるクローンを単離した。そのようなクローンを多数単離して調べたところ、ゲノムの４種類の領域の遺伝子が単離されており、それぞれの領域には、異なる酸化還元酵素をコードする遺伝子がコードされていた。それぞれについて、ギ酸脱水素酵素活性との関連性を検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初、大腸菌変異体の相補表現型からギ酸脱水素酵素と考えられた酵素について、試験管内での反応でギ酸に対する依存性が見られなかった。これは本研究に重要であるため、今年度はこの点を詰める研究に集中した。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初単離されていたNADPH合成酵素について、組換え体を用いた基質依存性の研究をさらに進めると共に、新たに単離した遺伝子についてそのコードする酵素活性とギ酸に対する応答性の検討を進める。さらに、アルカン生合成経路との関わりについても研究を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験の結果、NADPH合成酵素の基質依存性の解析に集中する必要じ、そちらを先に行うことにしたため、費用が当初の予定よりもかからなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
遺伝子の発現解析が必要になるため、それに必要な酵素・試薬類の購入等を行う。
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