| 研究実績の概要 |
これまでの難培養微生物を対象にした多くの解析が、培養を必要としないメタゲノム解析等であった。そのため、個々の微生物の遺伝子機能を明らかにすることは非常に困難であった。本研究ではCRISPR-Cas9システムを用いて、シロアリ腸内に共生する難培養性原生生物の遺伝子改変を行い、培養を介さない新たな遺伝子機能解析方法の確立を目指した。まず、原生生物のゲノム配列からCRISPR-Cas9で切断する部位を決定するために、シロアリ腸内共生原生生物のドラフトゲノムから標的とする結晶性セルロース分解酵素セロビオハイドロラーゼ(Cel)遺伝子の探索を行った。このCel遺伝子配列からガイドRNAの設計を行った。また、Cel遺伝子のコドン使用頻度を求め、Cas9遺伝子、GFP遺伝子のコドンの最適化し、DNA合成を行った。合成DNAを鋳型に逆転写反応により、Cas9, ガイドRNAのRNA鎖を作製し、また相同組換え用のCel遺伝子の切断箇所にGFP遺伝子を組み込んだDNA配列を作製した。
Cas9 mRNA, ガイドRNA, Cel-GFP DNAを染み込ませたろ紙を餌にシロアリを飼育し、経時的に腸内容物をサンプリング、PCRによる遺伝子組換えの有無を調べた。しかし、遺伝子が組換えを示す結果は得られなかった。mRNA, DNAが腸内に届いていないと考え、マイクロマニピュレーターにより直接腸内への注入を行った。注入は成功したものの、数時間でシロアリが死んでしまい、遺伝子組換え原生生物を取得できなかった。CRISPR-Cas9システムに必要なmRNA, DNA配列の作製は完了していることから、今後はシロアリ腸内への効率的な注入方法を検討していく。また、原生生物には細胞内外に細菌が共生しており、ゲノム解析においてミスアッセンブリ等の原因となるため、これらの細菌のゲノム配列を取り除く必要がある。今回の研究の過程で、原生生物細胞表面に共生する細菌のゲノムを決めることに成功し、論文発表した。
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