| 研究課題/領域番号 |
26660083
|
|---|
| 研究機関 | 東京大学 |
|---|
研究代表者 |
伏信 進矢 東京大学, 農学生命科学研究科, 教授 (00302589)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| キーワード | 糖質関連酵素 / グリコシダーゼ / シロイヌナズナ / イネ / β-アラビノオリゴ糖 |
|---|
| 研究実績の概要 |
我々は、糖質加水分解酵素(GH)ファミリー127および機能未知ドメイン(DUF)1680に分類されるβ-アラビノフラノシダーゼの活性中心が亜鉛に結合したシステインであることを明らかにした。システイン型の酵素はプロテアーゼではよく知られているが、グリコシダーゼでは前例がない。GH127-DUF1680は細菌、真核微生物、植物のゲノムに見つかり、植物細胞壁のヒドロキシプロリン-リッチ糖蛋白質(HPRG)および糖ペプチドホルモンの分解および再構築、ひいては植物の発生と成長に関わると予想されるが、機能と構造が分かっているものはビフィズス菌の酵素１種類のみである。本研究ではシロイヌナズナとイネのDUF1680タンパク質の機能を調べ、立体構造解析などを組み合わせてその作用機構を明らかにすることを目的とする。
本年度は、理化学研究所と農業生物資源研究所からシロイヌナズナとイネ（日本晴）のcDNAライブラリーを取り寄せ、シロイヌナズナから２種（AT5G12950,AT5G12960）、イネから３種（Os02g10190,Os06g41020,Os06g41030）のDUF1680遺伝子をクローニングした。現在、大腸菌での発現条件を検討中である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
cDNAライブラリからのクローニングにおいてプライマー設計の最適化が必要であった。
|
| 今後の研究の推進方策 |
クローニングした遺伝子の異種宿主での発現条件を決定する。宿主は大腸菌(Escherichia coli)および酵母(Saccharomyces cerevisiaeとPichia pastoris)を用いて、タンパク質を発現する。発現量確保および精製のために、必要に応じて各種タグや融合タンパク質(ポリHis、FLAG、GSTなど)を利用する。大腸菌ではレアコドンtRNA強化株(CodonPlusおよびRosetta)やtrxB/gor変異株(Origami；サンプルのアミノ酸配列中のCysの数は8～13個)を用いる。HypBA1では大腸菌培養の際に培地中に0.5 mM ZnSO4を添加すると精製タンパク質中の亜鉛含有量が安定することが分かっている。P. pastorisでは各種グリコシダーゼで成功例が多い菌体外発現システム（α-factorを利用したもの）も試す。
蛋白質精製にはIMACアフィニティ、イオン交換、ゲル濾過、疎水、ヒドロキシアパタイトなどのカラムクロマトグラフィーを用いて、これらの組み合わせで最適な条件を探る。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
遺伝子クローニングにおいて、PCR条件の検討などに時間がかかったことから、本年度に計画していた大腸菌およびPichiaでのタンパク質発現条件検討が来年度になったため。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
各種の大腸菌ホストおよびPichia酵母を用いてタンパク質発現条件を試す。そのための遺伝子工学的試薬、生化学試薬、培地、実験器具（消耗品）に用いる予定である。
|
