| 研究課題/領域番号 |
26660095
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
松井 健二 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90199729)
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| 研究分担者 |
田中 秀平 山口大学, 農学部, 教授 (50116729)
肥塚 崇男 山口大学, 農学部, 助教 (30565106)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | シロイヌナズナ / スクリーニング |
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| 研究実績の概要 |
根こぶ病原体休眠胞子を効率的に発芽させ、遊走子を確認する技術の確立を進めている。これまでハクサイ根こぶを室温で２週間ほど腐敗させ、極端に成熟させた休眠胞子を用いたが、その後、十分なサイズに成熟した根こぶを用いれば、腐敗処理しなくともそのままで休眠胞子を大量に得られることが明らかになった。こうして得られた休眠胞子は白菜芽生えの根毛の一次感染で評価した場合に十分な感染能力を有していたため、発芽し、遊走子を放出していることは明らかであるが、まだ十分な量の遊走子を観察するには至っていない。今後、半透膜で被覆した根を用いた実験系を確立し、感染前の遊走子の確認を進める必要がある。
これと平行して一次感染を指標とした簡便な感染アッセイの確立を進めた。シャーレ内で発芽させた１週間程度の白菜芽生えの根に休眠胞子懸濁液を与え、１日から３日後に観察すると根毛内に一次胞子嚢が見られた。同様の簡便な感染アッセイ系はシロイヌナズナでも確認できた。そこで、シロイヌナズナEMS変異体M2プールを準備し、より簡便に96穴マイクロプレート内で感染アッセイを実施することでスクリーニングが可能と考え、現在、そのシステムの確立を急いでいる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
発芽誘引物質の同定、という点ではやや遅れ気味であるが、これまでの研究の成果としてシロイヌナズナで変異体スクリーニングすることで、休眠胞子の発芽、遊走子の誘引、初期感染に関する植物側因子の確定が可能となることが判明したため、順調に進展しつつあると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまで研究の進展を妨げていた煩雑な操作をかなり排除し、かなり簡便な感染アッセイシステムの確立に成功した。今後、このシステムをより効率よいものにし、96穴タイタープレートを用いたハイスループットなスクリーニングシステムにする必要がある。このアプローチについては準備段階を終えているので鋭意進める。
一方、休眠胞子発芽促進物質の単離については遊走子の確認頻度があまりにも低いため思い通りに進められていない。これは遊走子が文字通り遊走するため顕微鏡下での確認が困難であること、また、その寿命が短くいために確認が難しいと考えられる。そこで、哺乳動物細胞培養用の細孔プレートを用い、一定容積の空間に休眠胞子をひとつずつ閉じ込めた状態で発芽を見るシステムを確立する必要がある。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度予定していた発芽誘引物質の単離精製構造決定を完了しなかった。これに予定していた経費を次年度に請求し、完全に構造決定することとしたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
活性因子精製のためのカラム、有機溶媒一式。また、NMR測定のためのガラス器具、溶媒類。同時にあらたに計画しているシロイヌナズナ変異体スクリーニングのための基剤などの購入費用に充てる。
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