| 研究課題/領域番号 |
26660268
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
早川 徹 岡山大学, 自然科学研究科, 助教 (30313555)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | タンパク質生産 / ペプチドタグ / 凝集体形成 / Cry4Aa / Bacillus thuringiensis / 大腸菌 |
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| 研究実績の概要 |
4AaCterはBt菌が産生する殺蚊トキシンCry4Aaに由来するポリペプチドで、タンパク質をアルカリ可溶性の凝集体として生産・蓄積するためのペプチドタグ(特許第46042321号、US patent 8865428)である。凝集体形成には4AaCter内部で高度に保存されている配列(Block7, 33アミノ酸)が重要な役割をもつと考えられ、その詳細を明らかにすることは4AaCterタグを今後利用していく上で重要と考えられる。本研究では昨年度にBlock7(B7)欠失変異体を構築し、タンパク質凝集体形成率の変動から2カ所の機能領域MIF1 (F802PTYIFQKI)及びMIF2 (Y821LVRGFVGS)を特定するに至っている。
本年度は引き続き凝集体形成の仕組みを明らかにするための研究を進めた。まずMIF1及びMIF2を含む合成ポリペプチドを新規に作製、QCM法でポリペプチド同士の結合を解析した。その結果MIF1及びMIF2同士、MIF1とMIF2の間の解離定数(KD)はそれぞれ6.6±3.8, 1.4±0.9, 4.8±2.8 uMと見積もられ、MIF1とMIF2がホモもしくはヘテロに結合することが明らかになった。またアフィニティカラムクロマトグラフィーを利用した解析から、MIF1と結合する49 及び 52 kDaの大腸菌タンパク質を検出した。4AaCterタグによって形成されたタンパク質凝集体は、MIF間の結合及びMIF1と大腸菌タンパク質との結合によって形成される可能性が示唆された。また本年度はタンパク質生産にBt菌israelensis株に由来するシャペロン様P20タンパク質を利用する目的で、新規な発現ベクターpP20を構築した。pP20は目的タンパク質遺伝子とp20遺伝子の両方をポリシストロニックな形でコードするmRNAを転写するようにデザインされている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度はペプチドタグ4AaCterによるタンパク質凝集体形成機構の解明を目的として解析を進めた。その結果、4AaCter内部で高度に保存されているBlock7配列内部で特定された2カ所の機能領域MIF1及びMIF2がホモもしくはヘテロに結合できること、そしてMIF1と結合する49及び52 kDaの大腸菌タンパク質が存在することを明らかにできた。MIF同士の結合及びMIF1と大腸菌タンパク質の結合は、昆虫消化液と同様なpH 10のアルカリ条件下で解離することが明らかになり、これらの結合が4AaCterによるタンパク質凝集体形成の基幹部分を担うと考えられた。現在はこれら49 及び52 kDaの大腸菌タンパク質を同定するための解析を進めている。また本年度に予定していたシャペロン様P20を利用するタンパク質発現系の構築に関しても新規な発現ベクターpP20を構築するに至っている。この新規な発現ベクターpP20の利便性を解析するための研究を現在進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
（理由）
本研究により4AaCterタグの凝集体形成機構が明らかになりつつある。その結果で特に注目すべき点は、タンパク質凝集体の形成に関与する機能領域（MIF1及び2）が特定できたことである。本研究の結果からMIFはpH依存的に脱着するマジックテープのようなものであることが明らかになっており、これを利用すれば単なる凝集体の形成でなく、より高度な造形物を構築することも可能と期待された。
（推進方策）
本年度は4AaCterタグの新展開として、機能領域MIFの結合を利用した凝集体よりも高度な造形物の作製を試みる。具体的には機能領域MIFを含むポリペプチドを大腸菌等で大量生産し、それをアルカリ条件下で可溶化、ポリペプチドを糸状に成形することを試みる。また4AaCterタグの利便性を明らかにするための研究も進める。具体的には本タグを用いた可溶性Cryトキシン、例えばCry4Aaのように凝集体形成ドメインを含むタンパク質C末端領域を持たないCryトキシンの製剤化を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究はおおむね順調に進展しているものの、凝集体形成機構の解明に関してMIF1と結合する49及び52 kDaの大腸菌タンパク質の同定には至っていない。また本研究ではシャペロン様P20を共発現するベクターpP20を新規に構築したが、次のフェーズである実際のタンパク質生産には至っていない。
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| 次年度使用額の使用計画 |
主にMIF1と結合する大腸菌タンパク質の同定、及びpP20を利用して生産するタンパク質遺伝子の構築費用に利用する。
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