| 研究課題/領域番号 |
26660289
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
荒川 孝俊 東京大学, 農学生命科学研究科, 助教 (30523766)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | タンパク質工学 / 代謝型受容体 |
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| 研究実績の概要 |
本課題では、受容体の立体構造情報に基づき適当な変異を加えることにより特異的合成リガンドに対する化学プロセス能を付加することを目指す。初年度では、以下に示すように対象受容体の設定ならびに組換え発現および可溶化の可否を確認した。対象とする受容体として既知の薬剤シード化合物が多く開発されている代謝型受容体（アミン受容体、ヌクレオチド受容体、オリゴペプチド受容体）の中から計10種を選び、それぞれ発現領域の異なるバリアントを、そのコード配列のカルボキシ末端側へ蛍光タンパク質を融合させた形態としてYEp型プラスミドに挿入し、発現ベクターを作製した。これらを用いてSaccharomyces酵母を形質転換し、ガラクトース添加により発現が誘導された菌体の破砕物について超遠心分離を行って膜画分を回収した。回収された画分をSDS可溶化し、電気泳動法での蛍光バンド強度で比較定量することで対象受容体の発現性を評価した。その結果、膜から露出したループ配列の欠失・置換により発現性に大きな差が生じることが判明し、例えばマウスドーパミンD1受容体では、全長配列では融合タンパク質に由来する蛍光がほぼ見られなかった一方で、C末端側20-80残基を切除した場合に対照受容体（ヒトアデノシンA2a受容体）と同程度の蛍光が観察された。高い発現性を示すバリアントについて蛍光ゲルろ過法(FSEC)により、主としてアルキルマルトシド-コレステロール混合界面活性剤に対する可溶性状および安定性の調査を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本課題を実施するためには対象となる受容体が発現宿主内で得られている必要がある。本年度は受容体の対象設定ならびに発現検討を進めた結果、酵母宿主を用いた場合に組換え受容体が膜画分に再現的に発現することが確認できた。これを受け、次年度では所与の変異体を作成し、放射性リガンドの結合により受容体活性の保持状況を監視しながら、付与活性を評価する段階に着手できるようになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度で獲得された受容体タンパク質について、宿主での局在性を確認したうえで受容体のリガンド結合活性を確認する。活性をもち、細胞膜上に正常に移行しているものについては結合活性半減期などの可溶化試料の安定性を見積もりながら、活性サイト付近の点変異体の作成を進める。作製された変異体については、リガンド結合活性の変化の追跡ならびに期待される酵素活性に応じた測定系を設定し、その確認を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
申請当初の予定では初年度で一般試薬や器具の他、対象受容体の遺伝子合成ならびに解析費用、解析ソフトウェア、専用計算装置とデータストレージの購入を予定していた。しかし、課題の推進に際しては、受容体タンパク質の発現性状検討に必要でかつ未整備機器であった液体クロマトグラフィー装置を当予算で購入し、計算装置は研究室所有の既存装置で対応することが適当であると判断し、当該機器に使途を変更し購入した。そのため、交付申請額と使用額に差額が生じることとなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
生じた次年度使用額については、主として物品費、特に活性測定のための合成リガンドやアイソトープ標識体、細胞の総蛍光強度測定のための検出系統、ならびに専用計算機の購入に充当することを予定している。
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