| 研究課題/領域番号 |
26660289
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
荒川 孝俊 東京大学, 農学生命科学研究科, 助教 (30523766)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | タンパク質工学 / 代謝型受容体 / 膜タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
本課題では、立体構造情報に基づいた適当な変異を加えることにより、受容体の特異的合成リガンドに対する新規化学プロセス能を付与することを目指す。初年度で行った対象受容体の設定ならびにSaccharomyces酵母組換え発現の結果を踏まえ、本年度は対象受容体(ドーパミンD1、アデノシンA2a、セロトニン5HT1B等の変異体計9種類)の大量発現用酵母宿主Pichia pastorisへの安定発現株の作製、可溶化条件の探索と最適化を行った。具体的には次のように進めた。YEp型プラスミドで構築された、変異体のカルボキシ末端側へGFP融合させた配列をpPIC9 およびpPICZ系へ付け替えてP. pastorisの発現ベクターを作製した。電気穿孔法でベクターを宿主へ導入し、抗真菌剤マーカーにより選択されたコロニーをメタノール添加培地に移して発現誘導を行った。菌体総蛍光の高いコロニーを選別することで、細胞あたりのコピー数が多く高発現量である形質転換株を得た。培養温度、誘導日数での発現条件の最適化を行ったのち菌体の破砕物について超遠心分離を行って膜画分を回収した。この画分をアルキルマルトシド-コレステロール混合界面活性剤により可溶化したものを用いて蛍光ゲルろ過法(FSEC)による主ピークの性状評価を行った。この結果、上記に挙げた対象受容体に対して、可溶化物について安定性と単分散性を維持した条件で単離精製する指針が定められた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
受容体の変異体を設計し、高発現性膜画分を生産し、精製を行い活性を測定する一連の過程を通じて本課題が遂行される。本年度は受容体の対象設定ならびに発現検討を進めた結果、高発現宿主であるPichia酵母を用いた際の組換え変異型受容体が細胞膜画分に発現し、可溶化剤による変性を起こさずに膜画分から回収できることが確認された。膜標品から精製に至る工程の方針が立てられたことから、対象受容体標品の活性を評価する段階に着手できるようになった。現在、特異的アンタゴニストに対する分解活性付与を想定した活性の測定・検出系の策定を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度では活性を評価する段階に着手する。具体的には上記発現株を用いて受容体変異体を中スケールで獲得し、可溶化・精製を行う。受容体としてのラジオリガンド結合活性の保持状況を確認し、触媒としての化合物変換活性をクロマトグラフィーや質量分析を用いて測定する。既知構造モデルにおける薬剤の水和度および受容体表面の極性の程度から誘導適合性や変異体における基質のドッキングポーズを考察し、活性サイト付近の物理化学的特性変化を総括する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度使用額の主な充当先は、細胞の総蛍光強度を測定するために購入した、プレートリーダーの制御PCとソフトウェア(本体は研究室に既設のものを使用)である。年度開始時に予定していた専用計算機は共用施設の利用によって所属研究室既設のPCを用いた処理が可能となり購入しなかったため、次年度使用額が生じることとなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度配分費用については、主として物品費、特に活性測定のための合成リガンドやアイソトープ標識体と各種アッセイにおける分離検出器具、学会発表のための旅費ならびに誌上報告のための費用に充当することを予定している。
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