研究課題/領域番号 |
26670012
|
研究機関 | 京都大学 |
研究代表者 |
松崎 勝巳 京都大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (00201773)
|
研究分担者 |
矢野 義明 京都大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (60402799)
星野 大 京都大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (70304053)
|
研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2016-03-31
|
キーワード | 膜タンパク質 / 可溶化剤 / 脂質ナノディスク / 無細胞合成 |
研究実績の概要 |
生体膜脂質の部分構造を持ち、かつ高分解能NMRに適した小さいサイズのGPCR―脂質複合体を形成するような新規可溶化剤の開発を目指して研究を行った。本年度はこれまで合成したCholyl–PC精製法の改良、Cholyl-PAの合成を行った。Cholyl–PCをホスホリパーゼD処理する事で、Cholyl-PAを合成した。また、バクテリオロドプシンbRはこれまで紫膜を購入していたが、培養した高度好塩菌から精製するよう培養系を立ち上げた。Cholyl-PCがbRを変性させずに可溶化できる事、熱安定性が高い事を確認した。また蛍光標識bRのFCS測定により、Cholyl-PCが46分子程度で1つのbRを可溶化していることが示唆された。Cholyl-PC/Cholyl-PA混合物ではbRの可溶化能が少し上昇した。 非天然蛍光アミノ酸 (TAMTA-C6-AF) をN末端に導入し、コイルドコイル用タグ(E3)を付加したβ2 アドレナリン受容体(TAMRA-E3-β2AR)の合成系を用いてリガンド結合能を持つ受容体を得られるか検討した。可溶化剤存在下での合成を試みたところ、digitonin等の存在下でもβ2ARを合成できる事がわかった、しかし、cholyl–PC存在下では合成量が大きく減少した。これらの可溶化剤存在下でもアフィニティービーズ(alprenolol-agarose)への結合は見られなかった。また、リガンド存在下で同様に無細胞合成を行った後に可溶化剤を除去、アフィニティービーズを添加して共焦点顕微鏡で観察したが、ビーズへの選択的結合は見られず、凝集体が多数見られた。よってリガンド存在下でもリガンド結合能を持つ受容体は見られなかった。
|
現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
可溶化剤、bRについて合成法を確立したため、NMR測定に向けての準備が整いつつある。β2ARについてポリペプチド合成は可能なものの、正しくフォールドした受容体を得るため引き続き検討の必要がある。
|
今後の研究の推進方策 |
引き続き脂質頭部を変えた可溶化剤の合成、bRの可溶化能の確認、FCS測定を行い、最適な組成でNMR測定を行う。β2AR合成については、membrane scaffolding protein 等が形成する脂質ナノディスク存在下でリガンド結合能を持つ受容体を合成した後に、本研究で開発した可溶化剤へ置き換えることができないか検討する。
|
次年度使用額が生じた理由 |
一部試薬が当初見積もりより安価であったため。
|
次年度使用額の使用計画 |
可溶化剤合成関連試薬を購入する。
|