| 研究実績の概要 |
本申請研究では,「細胞の主要な膜レセプターであるGPCRの活性が, 隣接する他の細胞のGPCRを活性化する」というレセプターの概念を超えた現象を裏付け, 証明するため, ルシフェラーゼを基盤とした発光プローブを開発し, GPCR 活性を細胞レベルで発光検出する.
最終年度では, 発光プローブの開発としてGPCR-arrestinの相互作用だけでなく, 細胞間密度を認識し細胞分裂を制御するタンパク質因子YAP2に着目した. まずYAP2による遺伝子発現の促進を検出するために, YAP2と転写関連因子TEAD2それぞれにNanoLuc断片を繋げた新規のプローブを準備した. また, これまでに報告例がないYAP2-GPCR間の相互作用が実際に起きているかどうかを確認するために, このペアに対してもプローブを作製した. 発光を測定した結果, 細胞密度の異なる状況でYAP2-TEAD2相互作用及びYAP2-GPCR相互作用それぞれの程度が変化することが明らかとなった.
顕微鏡観察システムの改良としては, 前年度までに行った発光観察用のセットアップに加えて, 複数波長の発光, 蛍光をタイムラグなく同時に観察できるようにEM-CCDカメラのCCD部分を二つの領域に分ける作業も行った. 具体的には, ミラーを搭載した分光器を対物レンズとEM-CCDカメラの間に設置した.
研究期間全体を通して,複数の細胞でのGPCR活性の発光検出, さらに細胞の密度を検知して増殖シグナルを誘導するYAP2-TEAD2相互作用の発光検出に成功した. この検出法は細胞間での活性の伝達を行う上で不可欠な細胞接着認識シグナルをモニターすることに繋がるため, 伝達様式の詳細な解明に向けた大きな成果である.
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