| 研究課題/領域番号 |
26670050
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
供田 洋 北里大学, 薬学部, 教授 (70164043)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | マルチカッパーオキシダーゼ / ビアリルカップリングエンザイム / ダイナピノンA / 二量体化 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、我々が真菌Talaromyces pinophilus FKI-3864から発見したmonapinone A (MPA)をビアリル型二量体化合物dinapinone A (DPA)へと生合成するモナピノン二量化酵素(monapinone coupling enzyme, MCE)に焦点をあて、軸異性を有するビアリル型ナフトキノンを生成する反応機構を明らかにすることを目的とする。平成27年度は、1) 異種発現系を用いたMCEの調製方法を検討した。さらに、2) DPAやMPAと類似の構造を有するvioxanthin (VX)やsemivioxanthin (SVX)の生産菌から、二量体化に関わる酵素(semivioxanthin coupling enzyme, SCE)についても検討した。最終的に、大量調製したMCEやSCEの 二量体化反応機構の解明、X 線結晶構造解析へと展開させる。さらに、MCEやSCEを用いて、新規二量体化合物の探索も行ない、創薬シーズとして化学合成が困難なライブラリの提供を目指す。
1) MCEの異種発現系の確立および大量精製
MCEの異種発現システムの宿主として、Escherichia coli、Aspergillus oryzae及びSaccharomyces cerevisiaeを選択した。さらに、精製ステップを容易に行なうために、インタクトなMCEだけでなく、Hisなどのタグを付加したMCEについても検討した。それぞれの組み合わせの中で、A. oryzaeを用いた場合、活性及びSDS-PAGEによるバンドの確認に成功した。現在、その精製を進めている。
2) VXの二量体化酵素SCEの解析
VX生産菌からゲノム情報を取得し、二量体化酵素SCEの候補遺伝子の特定に成功した。現在、1)で確立した異種発現システムを適用し、検討を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
いくつかの異種発現システムを用いて、MCE をリコンビナントタンパク質として確認できる系の確立に成功した。中でも、真核生物 (A. oryzae) の宿主ベクター系を用いると、高活性なインタクトな MCE もしくは Hisタグをつけた MCE を確認した。そこで、インタクトな MCE については、平成26年度に構築した生産菌からのMCEの効率的な精製方法を適用し、Hisタグをつけた MCEについてはアフィニティーカラムでの精製を検討している。
また、SVX の二量体化に関わる酵素SCE の候補遺伝子を特定し、異種発現システムを用いて、SCE をリコンビナントタンパク質として確認できる系の確立にも成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
1) 異種発現システムを用いた MCE の大量精製：平成27年度に確立した A. oryzae を用いた異種発現システムと平成26年度に確立した MCE の効率的な精製方法を組み合わせ、MCE を大量取得する。また、タグをつけた MCE については、アフィニティーカラムを用いた精製をすすめ、MCE による二量体化機構を解明する。最終的に、大量にMCE を調製し、X 線結晶構造解析を目指す。
2) SVX の二量体化に関わる酵素 SCE の解析：SVX 生産菌から特定した SCE について、酵素学的解析を進める。さらに、基質特異性や生化学データ (至適反応温度、至適pH、塩に対する影響など) を MCE と比較することで、立体化学を制御した二量体化機構の解明につなげる。
3) MCE や SCE を用いた新規二量化化合物の探索：T. pinophilus FKI-3864より発見した DP 類は、それぞれを構成する MP 類が MCE によって二量体化すると予想しているが、すべての DP 類が MCE により酵素的に合成されるのか、および基質分子との親和性の検討進める。さらに、類似の構造を示す SVX 、我々の所有する天然化合物ライブラリや有機化学合成の手法を用いて非天然型の単量体類縁化合物について、MCE との基質特異性を検討し、生物活性を評価する。最終的には、化学合成が困難な二量体化合物ライブラリを作成する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初、平成２６年度に計画していたゲノム塩基配列の解析が年度内に終了せず、納品が平成２７年度になったため、当該年度の予算に繰り越しが生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成27年度にゲノム塩基配列の解析が終了し、納品、支払いを終了した。平成28年度は、申請当初の研究計画及び今後の研究推進方策にしたがって進めていく。
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