ヒストン修飾酵素の機能に関する網羅的スクリーニング

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26670085
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 中山 啓子 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60294972)
• 研究分担者: 舟山 亮 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20452295)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: CRISPR/Cas9 / メチル化酵素 / ES細胞 / 3T3-L1

研究実績の概要

本研究では、以下の二つのステップを行った。(1) ゲノム修飾を誘導するためのguide RNAの導入、(2) 超並列シークエンス解析によって集団を構成する細胞の決定、である。
ゲノム修飾を誘導するためのguide RNAの導入。まず導入ベクターの開発を行った。「PrecisionX Cas9 SmartNuclease System (SBI)」を用いて、EEDなどのヒストン修飾酵素の遺伝子破壊をES細胞および3T3-L1細胞で行う。複数の遺伝子を対象とし、各タンパク質についてさまざまな点変異の導入を試みた。EED遺伝子に加えてPRC2複合体を構成するEZH2遺伝子などを対象とした。ついで、細胞への導入条件による導入効率の検討を行った。ベクターをES細胞や3T3-L1細胞に導入し、導入効率を判定した。3T3-L1細胞での複数個の遺伝子の同時に変異の導入を試みにおいては、150クローンの細胞のゲノムDNAから標的領域をキャプチャー・増幅して、クローン番号を識別が可能な塩基配列のアダプターを付加した後に次世代シークエンサーで塩基配列の決定を行った。150クローンをシークエンスの結果を根拠に5種類のグループに分類した。同様の実験をES細胞でも行い、シークエンスの結果を得ることができた。
ES細胞および3T3-L1細胞の分化誘導条件を検討した。条件検討は、分化マーカーの発現量の変化と、未分化マーカーの発現量の低下を根拠とした。また、同一実験を3回行い、再現性の確認を行った。
ES細胞で、クローニングされた細胞が未分化性を維持していることの検証を行ったが、半数のクローンで分化マーカーの発現が確認され、実験操作によって未分化性の維持が破綻したのか、遺伝子破壊による影響であるのかの検証を行うことはできなかった。

研究成果

• [雑誌論文] CRL4(VprBP) E3 Ligase Promotes Monoubiquitylation and Chromatin Binding of TET Dioxygenases. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nakagawa, T., Lv, L., Nakagawa, M., Yu, Y., Yu, C., D'Alessio, A. C., Nakayama, K., Fan, H. Y., Chen, X. & Xiong, Y
  • 雑誌名: Mol Cell 巻: 57 ページ: 247-260
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2014.12.002
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Identification of acquired mutations by whole-genome sequencing in GATA-2 deficiency evolving into myelodysplasia and acute leukemia (2014)
  • 著者名/発表者名: Fujiwara, T., Fukuhara, N., Funayama, R., Nariai, N., Kamata, M., Nagashima, T., Kojima, K., Onishi, Y., Sasahara, Y., Ishizawa, K., Nagasaki, M., Nakayama, K. & Harigae, H.
  • 雑誌名: Ann Hematol 巻: 93 ページ: 1515-1522
  • DOI: 10.1007/s00277-014-2090-4
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] HCV infection enhances Th17 commitment, which could affect the pathogenesis of autoimmune diseases. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kondo, Y., Ninomiya, M., Kimura, O., Machida, K., Funayama, R., Nagashima, T., Kobayashi, K., Kakazu, E., Kato, T., Nakayama, K., Lai, M. M. & Shimosegawa, T.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9 ページ: e98521
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0098521
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] GNE myopathy associated with congenital thrombocytopenia: a report of two siblings (2014)
  • 著者名/発表者名: Izumi, R., Niihori, T., Suzuki, N., Sasahara, Y., Rikiishi, T., Nishiyama, A., Nishiyama, S., Endo, K., Kato, M., Warita, H., Konno, H., Takahashi, T., Tateyama, M., Nagashima, T., Funayama, R., Nakayama, K., Kure, S., Matsubara, Y., Aoki, Y. & Aoki, M.
  • 雑誌名: Neuromuscul Disord 巻: 24 ページ: 1068-1072
  • DOI: 10.1016/j.nmd.2014.07.008
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] マウスES細胞におけるgemininの細胞周期と分化に対する制御 (2014)
  • 著者名/発表者名: 福本恵美子, Kundu, Lena Rani, 佐藤聡一郎, 細金正樹 & 中山啓子
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2014-11-27 – 2014-11-27
• [学会発表] H3K27me3修飾パターン形成過程の時系列解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 細金正樹, 舟山亮, 城田松之 & 中山啓子
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2014-11-27 – 2014-11-27
• [学会発表] 精子形成におけるE3ユビキチンリガーゼβ-TrCPの新規基質の同定と解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 久志瞭, 中川直, 中野星児, 遠藤尚博 & 中山啓子
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-25
• [学会発表] TFIID complex changes accompany epithelial-mesenchymal transition (EMT) (2014)
  • 著者名/発表者名: Nakagawa, Tadashi & Nakayama, Keiko
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-25
• [学会発表] がん遺伝子による転写変化とエピゲノム変化 (2014)
  • 著者名/発表者名: 中山啓子
  • 学会等名: 第23回長崎障害者支援再生医療研究会
  • 発表場所: 長崎大学医学部良順会館（長崎県長崎市）
  • 年月日: 2014-11-04 – 2014-11-04
  • 招待講演
• [備考] がん医学コアセンター 細胞増殖制御分野
  • URL: http://www.devgen.med.tohoku.ac.jp/index.html