| 研究課題/領域番号 |
26670093
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
吉川 知志 神戸大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90244681)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | クロマチン再構成複合体 / ゲノム編集 / 神経細胞分化 / ゼブラフィッシュ |
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| 研究実績の概要 |
前年度より引き続き、常法に従い各標的遺伝子（BAF複合体構成因子群）に対するガイドRNAを標的配列をクローニングした鋳型プラスミドよりin vitro転写により合成し、Cas9 RNAと共に野生型ゼブラフィッシュ受精卵に注入した。各標的遺伝子に対して当初それぞれ２種類のガイドRNAを作製し、いずれのガイドRNAの編集効果も期待通りでない場合には新たに標的配列を追加し再トライしている。RNA注入の数日後に各編集標的領域近傍のゲノムPCR断片を胚より増幅し、T7ヌクレアーゼアッセイによりゲノム編集の有無を評価したところ、多くのガイドRNAにおいて非常に高い効率（注入胚の60％超）で標的ゲノム領域に何らかの編集が生じていることが確認された。現在、dpf1を含む5遺伝子についてゲノム編集箇所のDNAシークエンスなどの解析を行いつつ、F0~F2世代を順次、飼育中である。最初に着手したdpf1については、ゲノム編集の結果がフレームシフトを生じ、null変異が期待できる系統が複数得られており、F3ホモミュータントの作出ならびに表現型解析に取り組んでいる。また、表現型解析をより効率的に行うために、蛍光タンパク質トレーサーを発現する各種トランスジェニック系統とゲノム編集系統との掛け合わせを進行させている。現在までに、dpf1発現ニューロンのサブユニットポピュレーションにGFPを発現するdpf1-tTA-GFP系統と、広範囲の分化ニューロンにKaedeを発現するHuC-Kaede系統の遺伝的背景に被編集dpf1アレルを導入することに成功している。これらについても今後、適宜交配を行い、F3ホモミュータントの解析を順次行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ゼブラフィッシュ受精卵に対するゲノム編集実験については、当初計画したプラスミドの注入による方法は期待通りの編集効率を得ることはできなかったものの、より一般的な方法である合成RNAを注入する方法に変更する事で、これまでのところほぼ期待通りの編集結果を得ている。編集対象遺伝子を順次増やし、ゲノム編集系統の確立も進んでいる。一方で、F3ホモミュータント個体を用いたnull変異による表現型の解析は当初の研究計画より遅れているとの認識である。また、アンチセンスモルフォリノオリゴ（MO）を用いた遺伝子ノックダウンによるBAF45bの機能解析についても、当初期待したような結果を得るに至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
原則として交付申請書どおりに研究課題を進める。すなわち、ゲノム編集によるBAF複合体変異系統の作成とミュータントの表現型解析を同時並行的に進める。引き続き、BAF複合体構成各サブユニット（BAF45a、b、c、d 、BAF53a、b、BAF155、BAF170など）のゲノム編集系統の確立を行う。系統として確立された変異体から順次、蛍光蛋白質トレーサーを発現するトランスジェニック系統との交差交配等も行いつつ、ホモ変異体を作製する事で遺伝子ノックアウトが神経系発生に及ぼす影響を解析する。さらに、得られたホモ変異体を用いて、次世代シークエンサーによる遺伝子発現パターンの網羅的解析や遺伝子発現の定量的解析にも取りかかる。ゼブラフィッシュにおいて得られた表現型解析結果をもとに、マウス胚への子宮内エレクトロポーレーション法を用いた遺伝子ノックダウン実験などにより哺乳類中枢神経系の発生におけるBAF複合体構成各サブユニットの機能解析も試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ゲノム編集法をプラスミドを直接、注入する方法からRNAを合成して注入する方法に変更した事に伴い、価格が高価な直鎖化プラスミドキットの購入量が大幅に減ったため。また、現有機器の使用状況に鑑み、申請していたPCR装置の新規購入を現在のところ見送っているため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
当該プラスミドキットの購入を見込んでいた額を、新たに必要となったRNA合成用キット等とモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの購入費用に一部を振り替える。また、経費のかかる次世代シークエンサーによる遺伝子発現パターンの網羅的解析や定量PCR等の実験により多くの予算を執行することが可能になり、より多くの試料を解析できる。
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