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イオンチャネル開閉に伴う分子構造変化は、これまでチャネルタンパク質を可溶化・精製したもので研究が進められて来た。これに対して応募者は、国内唯一のZenike位相コントラストクライオ電子顕微鏡（ZPC-cryoEM）を使って、イオンチャネルの開閉に伴う構造変化を天然の膜中で可視化し、これを統計学的に処理して構造解析することを提案した。そこで本研究では、骨格筋の筋小胞体膜に存在するCa2+放出チャネル（リアノジン受容体：RyR）を小胞ごと活性が保たれた状態で抽出し、ZPC-cryoEMによる電顕トモグラフィーを行い、三次元再構築する。そして、個々のチャネル分子像を抽出して多変量解析により分類・平均化することで、天然の膜中における揺らぎも含めたイオンチャネルの構造変化と周囲の機能分子の動態を合わせて構造解析することを試みた。
ウサギ骨格筋より筋小胞体を精抽出して、これを急速凍結して電子顕微鏡グリッド上に氷包埋し、ZPC-cryoEMで観察した。その結果，小胞膜上にRyRと思われる突起状の構造物を確認することができた。この連続傾斜像を２°間隔で±60°の範囲で撮影し、電顕トモグラフィーによる立体再構成を行った。得られた三次元像に既知のリアノジン受容体の電顕マップ（EMDB ID: EMD-1274）をフィットすることによって、RyRの天然膜中での構造を確認することができた。現在のところ、観察できる膜中のRyRの数が非常に少なく解析に十分な解像度が得られていない。今後、引き続きRyR画像の数を増やすことにより、解像度を上げ、その上で開口条件におけるRyRとの構造比較を行う予定である。
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