研究課題/領域番号 |
26670118
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研究機関 | 山形大学 |
研究代表者 |
石井 邦明 山形大学, 医学部, 教授 (10184459)
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研究分担者 |
永澤 悦伸 東邦大学, 薬学部, 講師 (40513057)
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研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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キーワード | チャネル / GFP変異体 / イメージング / 心筋 / 受容体 |
研究実績の概要 |
動物摘出灌流心において、KCNQ1(ゆっくりと活性化する遅延整流性Kチャネルの主サブユニット)の細胞膜発現量の変化をリアルタイムで可視化できるモデルを確立することを目的に検討を行った。 1. pHluorin融合KCNQ1安定発現細胞株の作製と検討 昨年度の結果から、検討対象であるpHl-KCNQ1(pHluorin《pH感受性を有するGFP変異体》を、KCNQ1の細胞外領域に融合させたコンストラクト)の細胞膜発現量が不十分である可能性が考えられたため、pHl-KCNQ1を恒常的に発現するHEK293細胞を作製した。KCNQ1の細胞膜発現量を変化させるために、その細胞にα受容体を発現させ(これまでの検討でα受容体刺激がKCNQ1のエンドサイトーシスを惹起することを確認している)、共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討を行ったが、一過性発現の場合と同様、僅かなpHl-KCNQ1の蛍光量変化しか得ることが出来なかった。また、コントロールとして、顕著なエンドサイトーシスが起こることが知られているβ2受容体とpHluorinの融合コンストラクトを用いた検討も行ったが、KCNQ1の場合と同様の結果であった。 2.pH感受性GFP変異体に関する検討 GFP変異体のpH感受性変化に関して、これまでに知られている情報(アミノ酸の変異部位とpH感受性変化の関係など)をもとに検討を行ったが、細胞レベルにおいても、本研究の目的を達成するのに必要なシグナル変化を得ることは出来なかった。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
高いpH感受性を有し、pH変化によって大きな蛍光量変化を示すGFP変異体の作製に成功することが、本研究の目的を達成するにあたっての最大のポイントである。研究計画作成段階から、可能性のある一番の障壁は、それに成功するかどうかという点であると考えていたが、現在そこを乗り越えられずにいる。最終目標に到達するまでの道のりは、まだ遠く、進捗状況としては遅れている現状である。
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今後の研究の推進方策 |
GFP変異体のpH感受性について、これまで報告されている情報をもとにした検討だけでは、目的を達成できない可能性がある。今後は、ランダムな変異体の作製を行うことも検討する。目的に叶うようなGFP変異体を手に入れることが出来れば、その先の研究計画の変更は必要ない思われる。
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次年度使用額が生じた理由 |
最大の理由は、動物を用いた検討まで進むことが出来なかったことである。
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次年度使用額の使用計画 |
平成27年度に計画されていた研究を進めるために使用したい。
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