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神経細胞の機能は、その高度な極性構造を基盤としてシナプスを介した神経細胞間やグリア細胞との相互作用により制御されている。特定の神経機能に関与する膜タンパク質を同定し解析するためには、細胞間相互作用の場における時間分解能の高い方法を用いる必要がある。フルオレセイン標識抗体と光照射によるリアルタイム蛋白質不活性化法 (FALI) はそれに適した方法であるが、標的となる細胞表面の膜タンパク質を網羅する抗体（様）分子の調製とフルオレセイン標識を効率良く行うことが課題となっていた。本研究では、発現効率・安定性の高いスキャフォルドを持つ抗体（様）分子ライブラリーとcDNA display技術を組み合わせてこの問題を克服し、FALIを用いたハイスループット創薬標的探索を行うための基盤技術を確立することを目的としている。
本年度は、前年度に引き続きラクダ由来シングルドメイン抗体（VHH）スキャフォルドにランダムペプチド配列を挿入したライブラリーをcDNA display分子として発現させるための条件について検討を行った。神経細胞の細胞膜上に発現する膜タンパク質を標的とし、その分子の細胞外ドメイン組換えタンパク質に結合するVHHクローンをライブラリーから取得するためのトライアル実験を行い、結合cDNA displayクローンの選択、増幅・再構築の条件を検討した。
さらに発現効率を向上させるため、研究分担者である根本らが開発した改良型のピューロマイシンリンカーを用いてcDNA display分子発現の条件検討を行った。また、培養細胞の細胞表面への結合を利用したクローン選択の条件検討を行うため、EGF受容体の細胞外ドメインに結合するVHHクローンを作製し、cDNA display分子として発現させた。本クローンを用い、細胞表面におけるクローン選択技術確立のため実験を進めていく予定である。
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