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2015 年度 実施状況報告書

改良型レーザーカッターによるアミロイド物質の生体構造と機能解析

研究課題

研究課題/領域番号 26670152
研究機関信州大学

研究代表者

樋口 京一  信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (20173156)

研究分担者 八谷 如美  東京医科大学, 医学部, 教授 (30408075)
澤下 仁子  信州大学, 学術研究院医学系, 助教 (40359732)
矢崎 正英  信州大学, 学術研究院医学系, 准教授 (70372513)
研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2017-03-31
キーワードアミロイドーシス / プロテオーム解析 / 老化 / 実験病理学 / レーザーマイクロダイセクター / 線維蛋白質 / バイオ関連機器 / 凝集体
研究実績の概要

アミロイド物質の構造と機能と伝播性の解析のために、画期的なレーザーマイクロダイセクター(ALMD)を使用して、マウスとヒトアミロイドーシスにおける、アミロイド沈着の時間的、部位的微小空間を切り取り、プロテオーム解析とマウスを用いた伝播性解析に焦点を当てた研究を行なうことを目的とする。解析対象は、①AApoAII アミロイドーシス、②実験的AA アミロイドーシス、③神経変性疾患や全身性アミロイドーシス患者組織、である。平成27年度は以下のような研究実績を得た。
1. マウスAApoAIIアミロイドーシスでのプロテオーム解析ではマウスにAApoAIIアミロイド線維10 μgを静注してアミロイド沈着を誘発し、継時的に屠殺して肝臓を採取し、凍結試料と組織切片を作成した。凍結組織からアミロイド線維分画を抽出するとともに、組織切片のアミロイド沈着部位の周囲を超微細レーザーで焼き切リ、アミロイド沈着部位のみを採取して網羅的プロテオーム解析をおこなった。アミロイド沈着に特異的なアミロイドーシス関連蛋白質としてApolipoprotein E (ApoE), Clusterin, Vitronectin, CD81を同定した。それぞれの蛋白質のアミロドーシスの進行に伴う量的変動等を解析した。
2. 家族性アミロイドポリニューロパチー患者肝臓のドミノ移植を受けた患者の胃及び十二指腸のバイオプシー実施し、移植後14ヶ月で非常に微細なアミロイド沈着を観察した。アミロイド沈着を認めた患者組織切片から、ALMDを用いてアミロイド線維蛋白質を抽出し、質量分析を行った。その結果、FAP患者に由来する変異型TTR蛋白質の沈着であることを明らかにし、移植後2年では正常(wild)型のTTRも沈着することを明らかにした(Yoshinaga T, et al J Path: Clin Res 2016.)。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

研究分担者の八谷の開発した画期的なレーザーマイクロダイセクター(ALMD)は、改良が継続されている。ALMDは研究分担者の矢崎や研究代表者の樋口の研究グループをはじめとして、アミロドーシスの沈着蛋白質の同定に頻繁に利用されるようになり、利用頻度が顕著に増大しているため、新たな装置の製作が進行している。矢崎は平成27年度に、ALMDを用いて一般のレーザーダイセッションでは不可能であったごく微小な組織切片上のアミロイド沈着からアミロイド線維の抽出に成功した。FAP患者肝臓のドミノ移植を受けた後、世界で最も短期間(移植後14ヶ月)でFAP患者肝臓由来の変異型TTRでまず沈着し、さらにその線維にwild typeのTTRがわずかづつであるが沈着することを世界で初めて直接的に示すとこができたのは予想以上の成果であった(Yoshinaga T, et al J Path: Clin Res 2016.)。また、研究代表者は平成26年度にAApoAIIアミロイドが沈着したマウス肝臓の生化学的に分離したアミロイド線維分画と、とALMDで切り取ったアミロイド沈着領域の網羅的プロテオーム解析を行い、アミロイド沈着に特異的な関連蛋白質として同定したApoE, Clusterin, Vitronectin, CD81の詳細な量的変動や脂肪沈着との関連を解析した。その結果、ApoEはアミロイド線維分画中の量が急激に増大するが、血中濃度は急激に減少した。一方、血中のClusterin濃度は上昇することが明らかになった。これらは当初の計画以上の成果ということができ、その成果は学会等で発表した。一方で、パラフィン組織切片からのプロテオーム解析の感度向上に関しては、まだ改善されておらず、凍結組織を用いた解析も十分でない等、27年度に計画した研究の推進が十分に実施できなかったことが反省点である。

今後の研究の推進方策

平成28年度以降も27年度の研究の継続が必要である。特に研究分担者八谷は所属も変わり、ALMDの改良と利用促進を推進する。そのために昨年度発足させたダイレクトバイオロジー研究会の第2回の発表会を企画する。ホルマリン固定したサンプルや、既存の病理組織切片を用いたALMDとプロテオーム解析の感度の顕著な改善を目指して、研究グループ内外の協力を推進する。それに加えて28年度は27年度に進捗した研究をさらに発展させ、十分な成果が得られなかった以下の研究を実施を目指す。
1.順調に進捗した全身性アミロイドーシスのアミロイド蛋白質の同定をさらに発展させる。特にTTRのドミノ肝移植の患者でのアミロイド沈着の解析を継続し、wild type TTRの沈着やTTRの断片化について解析する。さらにTTRの構造安定化剤であるtafamidisの治療効果を明らかにする。また、AApoAIIアミロイドーシスの関連蛋白質の解析については論文発表を早急に行なう。
2.進捗が遅れている、マウスAApoAII やAAアミロイドーシスを発症したマウスの凍結切片を利用して、抗体染色後のALMDによる解析領域の切り出しとナノフローLC/MS/MSシステムを用いたプロテオーム解析の方法論の確立と推進を行う。また、切り出した空間のアミロイドーシス伝播力の解析を進める。具体的にはマウスにAApoAIIアミロイドーシスを発症させ、アミロイド沈着の中心から周辺に向かって切片を切り出し、SAMR1C-Apoa2c Tgに切り出した検体を投与し、2ヶ月後のアミロイド線維沈着を検出して伝播力を解析する。

次年度使用額が生じた理由

平成27年度は26年度で同定したアミロイドーシス関連蛋白質のWesterblotを主に用いた、血液やアミロイド線維分画中の量的解析を集中して行った。そのために、消耗品等の物品費等は増加したが、ALMD装置が設置されている、分担研究者である八谷の研究室へ向かう旅費が予定よりもかなり減少した。また、マウスの飼育や組織切片作成などの補助として、学生のアルバイトの謝金の支出を計画していたが、研究に参加した大学院学生が有効かつ効率的に実験を実施したために、アルバイトの必要がなくなり、その費用が計画より大幅に減少した。

次年度使用額の使用計画

次年度使用額は、平成28年度請求額と合わせて、計画的に使用し、さらなる発展を期す。
特に昨年度の研究成果を国際雑誌へ掲載するための費用や、昨年度に遅れの見られた、マウスAApoAII やAAアミロイドーシスを発症したマウスの凍結切片を作成して、抗体染色後とチオフラビンT染色後に、ALMDによる解析領域の切り出しとナノフローLC/MS/MSシステムを用いたプロテオーム解析の方法論の確立と推進を行う。特に、切り出した空間をマウスに投与して、アミロイドーシス伝播力の解析を進める。具体的にはマウスにAApoAIIアミロイドーシスを発症させ、肝臓の凍結切片を作成して、アミロイド沈着の中心から周辺に向かって切片を切り出し、SAMR1C-Apoa2c トランスジェニックマウスに切り出した検体を投与し、2ヶ月後のアミロイド線維沈着を検出して伝播力を解析する。

  • 研究成果

    (30件)

すべて 2016 2015 その他

すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 3件、 謝辞記載あり 3件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (23件) (うち国際学会 9件、 招待講演 11件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Distribution of transmissible amyloid proteins in the liver with apolipoprotein A-II amyloidosis.2016

    • 著者名/発表者名
      Liu Y, Sawashita J, Wang Y, Li L, Miyahara H, Ding X, Yang M, Higuchi K.
    • 雑誌名

      Shinshu Med J

      巻: 64 (4) ページ: 183-194

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] The pathological and biochemical identification of possible seed-lesions of transmitted transthyretin amyloidosis after domino liver transplantation.2016

    • 著者名/発表者名
      Yoshinaga T, Yazaki M, Sekijima Y, Kametani F, Miyashita K, Naomi Hachiya N, Tanaka T, Kokudo N, Higuchi K, Ikeda S.
    • 雑誌名

      J Path: Clin Res

      巻: 2 ページ: 72-79

    • DOI

      10.1002/cjp2.36

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] アミロイド線維の伝播とアミロイドーシスの発症。2016

    • 著者名/発表者名
      樋口京一
    • 雑誌名

      臨床検査学教育

      巻: 8 ページ: 20-26

  • [雑誌論文] 全身性アミロイドーシスの疾患感受性と個体間伝播。2016

    • 著者名/発表者名
      樋口京一
    • 雑誌名

      医学のあゆみ

      巻: 258 ページ: 印刷中

  • [雑誌論文] アミロイドーシス伝播の動物モデル。2016

    • 著者名/発表者名
      樋口 京一
    • 雑誌名

      Neuroinfection

      巻: 21 ページ: 80^87

  • [雑誌論文] The first pure form of Ostertag-type amyloidosis in Japan: a sporadic case of hereditary fibrinogen A α-chain amyloidosis associated with a novel frameshift variant.2015

    • 著者名/発表者名
      Yazaki M, Yoshinaga T, Sekijima Y, Nishio S, Kanizawa Y, Kametani F, Miyashita K, Hachiya N, Higuchi K, Ikeda S.
    • 雑誌名

      Amyloid

      巻: 22 ページ: 142-144

    • DOI

      10.3109/13506129.2015.1037389

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [学会発表] マウス血中にはAApoAIIアミロイドーシスを誘発・伝播する物質が存在する。2016

    • 著者名/発表者名
      丁欣、李琳、宮原大貴、劉穎業、澤下仁子、森 政之、樋口京一
    • 学会等名
      老化促進モデルマウス(SAM)研究協議会第31回研究発表会
    • 発表場所
      京都大学医学部芝蘭会館山内ホール (京都市)
    • 年月日
      2016-07-09 – 2016-07-10
  • [学会発表] SAMの老化/抗老化研究: from 1981 to 20162016

    • 著者名/発表者名
      樋口京一
    • 学会等名
      老化促進モデルマウス(SAM)研究協議会第31回研究発表会
    • 発表場所
      京都大学医学部芝蘭会館山内ホール (京都市)
    • 年月日
      2016-07-09 – 2016-07-10
  • [学会発表] Apolipoprotein A-II accelerates reactive AA amyloidosis.2016

    • 著者名/発表者名
      Yang M, Liu Y, Li L, Miyahara H, Ding X, Dai J, Sawashita J, Mori M, Higuchi K.
    • 学会等名
      The XV International Symposium on Amyloidosis
    • 発表場所
      Uppsala Concert and Congress (Uppsala, Sweden)
    • 年月日
      2016-07-03 – 2016-07-07
    • 国際学会
  • [学会発表] Caloric restriction prevents the progress of senile AApoAII amyloidosis in mice.2016

    • 著者名/発表者名
      Sawashita J, Li L, Liu Y, Ding X, Yang M, Xu Z, K Higuchi K.
    • 学会等名
      The XV International Symposium on Amyloidosis
    • 発表場所
      Uppsala Concert and Congress (Uppsala, Sweden)
    • 年月日
      2016-07-03 – 2016-07-07
    • 国際学会
  • [学会発表] The first pathological and biochemical identification of seed-lesions of transmitted transthyretin amyloidosis after domino liver transplantation.2016

    • 著者名/発表者名
      Yoshinaga T, Yazaki M,Sekijima Y,Kametani F, Hachiya N, Higuchi K, Ikeda S.
    • 学会等名
      The XV International Symposium on Amyloidosis
    • 発表場所
      Uppsala Concert and Congress (Uppsala, Sweden)
    • 年月日
      2016-07-03 – 2016-07-07
    • 国際学会
  • [学会発表] Prion-like transmission of mouse systemic amyloidoses.2016

    • 著者名/発表者名
      Higuchi K, Sawashita J.
    • 学会等名
      Korea-Japan Joint Meeting of Biomedical Gerontology
    • 発表場所
      Hotel Laonzena (Daegu, Korea)
    • 年月日
      2016-06-16 – 2016-06-17
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] 乳がん組織での血清アミロイドAの発現は予後不良に関連する。2016

    • 著者名/発表者名
      楊沐、 劉芳、 樋口佳代子、 澤下仁子、 付笑影、 張麗、 張瀾静、 傳 麗、Tong仲生、 樋口京一
    • 学会等名
      第105回日本病理学会総会
    • 発表場所
      仙台国際センター (仙台市)
    • 年月日
      2016-05-12 – 2016-05-14
  • [学会発表] Apolipoprotein A-IIの反応性(AA)アミロイドーシスに及ぼす効果(第2報)。2016

    • 著者名/発表者名
      楊沐、劉穎業、李琳、宮原大貴、丁欣、代健、澤下仁子、森政之、樋口 京一
    • 学会等名
      第105回日本病理学会総会
    • 発表場所
      仙台国際センター (仙台市)
    • 年月日
      2016-05-12 – 2016-05-14
  • [学会発表] 老化促進モデルマウス(SAM)を用いた老化・加齢の分子生物学的研究。2016

    • 著者名/発表者名
      樋口京一, 澤下仁子、森政之、島田厚良、細川昌則
    • 学会等名
      第41回日本脳卒中学会 STROKE 2016
    • 発表場所
      ロイトン札幌他(札幌市)
    • 年月日
      2016-04-14 – 2016-04-16
    • 招待講演
  • [学会発表] Aging and anti-aging studies using Senescence-Accelerated Mouse (SAM).2016

    • 著者名/発表者名
      Higuchi K.
    • 学会等名
      International Conference on Health Care of Aging, and the 2016 Annual Meeting for the Health Food Society of Taiwan and Anti- Aging and Health Society of Taiwan
    • 発表場所
      Shih Chien University (Taipei, Taiwan)
    • 年月日
      2016-03-05
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] マウスモデルを用いたアミロイド関連タンパクの網羅的解析。2015

    • 著者名/発表者名
      宮原大貴、劉穎業、丁欣、澤下仁子、森政之、樋口京一
    • 学会等名
      第38回日本分子生物学会年会 ワークショップ「アミロイド再考:これま でとこれから
    • 発表場所
      神戸ポートアイランド(神戸市)
    • 年月日
      2015-12-01 – 2015-12-14
    • 招待講演
  • [学会発表] Aging and anti-aging studies using Senescence-Accelerated Mouse (SAM).2015

    • 著者名/発表者名
      Higuchi K.
    • 学会等名
      The third BIT's Annual World Congress of Geriatrics and Gerontology
    • 発表場所
      Kaohsiung Exhibition Center (Kaohsiung, Taiwan)
    • 年月日
      2015-11-26 – 2015-11-28
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] アミロイドーシス伝播の動物モデル。2015

    • 著者名/発表者名
      樋口京一
    • 学会等名
      第20 回神経感染症学会総会・学術大会
    • 発表場所
      メルパルク長野 (長野市)
    • 年月日
      2015-10-22 – 2015-10-23
    • 招待講演
  • [学会発表] アミロイドーシスモデルを用いたアミロイド線維形成機構の解析と予防・治療法の構築をめざして。2015

    • 著者名/発表者名
      澤下仁子
    • 学会等名
      静岡県立大学第248回月例薬学セミナー
    • 発表場所
      静岡県立大学(静岡市)
    • 年月日
      2015-10-13
    • 招待講演
  • [学会発表] Transgenic mouse models of WT and D76N β2-microglobulin amyloidosis.2015

    • 著者名/発表者名
      Miyahara H, Yang M, Igarashi Y, Zhang P, Li L, Sawashita J, Thian G, Mori M, Higuchi K.
    • 学会等名
      Mini-workshop on Amyloidosis, Japan-Italy-UK
    • 発表場所
      University Collage London (London, UK)
    • 年月日
      2015-09-28 – 2015-09-30
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Aging research using mouse models:Senescence-Accelerated Mouse (SAM) and prion-like transmission of amyloidosis.2015

    • 著者名/発表者名
      Higuchi K.
    • 学会等名
      Special lecture in The First Hospital of Hebei Medical University
    • 発表場所
      Hebei Medical University (Shijiazhuang, China)
    • 年月日
      2015-09-12 – 2015-09-19
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] アミロイド線維の伝播とアミロイドーシスの発症。2015

    • 著者名/発表者名
      樋口京一
    • 学会等名
      第10回日本臨床検査学教育学会学術大会
    • 発表場所
      信州大学医学部(松本市)
    • 年月日
      2015-08-19 – 2015-08-21
    • 招待講演
  • [学会発表] マウスF型ApoA-IIのC末配列はAApoAIIアミロイド線維の活性末端に結合して線維伸長を阻害する。2015

    • 著者名/発表者名
      澤下仁子、矢崎正英、樋口京一
    • 学会等名
      第30回老化促進モデルマウス(SAM)研究協議会研究発表会
    • 発表場所
      岐阜大学サテライトキャンパス(岐阜市)
    • 年月日
      2015-07-04 – 2015-07-05
  • [学会発表] AApoAIIアミロイド沈着に伴い経時的に変化するアミロイド関連タンパク質の網羅的探索。2015

    • 著者名/発表者名
      宮原大貴、劉穎業、丁欣、澤下仁子、森政之、樋口京一
    • 学会等名
      第30回老化促進モデルマウス(SAM)研究協議会研究発表会
    • 発表場所
      岐阜大学サテライトキャンパス(岐阜市)
    • 年月日
      2015-07-04 – 2015-07-05
  • [学会発表] 運動とカロリー制限はマウス老化(AApoAII)アミロイドーシスの発症を軽減する。2015

    • 著者名/発表者名
      李琳、澤下仁子、劉穎業、丁欣、楊沐、徐哲、 森政之、樋口京一
    • 学会等名
      第38回日本基礎老化学会大会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(横浜市)
    • 年月日
      2015-06-12 – 2015-06-14
  • [学会発表] マウスF 型ApoA-II のC 末配列はAApoAII アミロイド線維の活性末端に結合して線維形成・伸長を阻 害する。2015

    • 著者名/発表者名
      澤下仁子、矢崎正英、樋口京一
    • 学会等名
      第38 回日本基礎老化学会大会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(横浜市)
    • 年月日
      2015-06-12 – 2015-06-14
  • [学会発表] Aging and anti-aging studies using Senescence-accelerated mice (SAM).2015

    • 著者名/発表者名
      Higuchi K.
    • 学会等名
      第38回日本基礎老化学会大会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(横浜市)
    • 年月日
      2015-06-12 – 2015-06-14
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] 運動はマウス老化(AApoAII)アミロイドーシスを抑制する2015

    • 著者名/発表者名
      李琳、澤下仁子、森政之、樋口京一
    • 学会等名
      第104回日本病理学会総会
    • 発表場所
      名古屋国際会議場(名古屋市)
    • 年月日
      2015-04-30 – 2015-05-02
  • [備考] 信州大学大学院 医学系研究科 疾患予防医科学系 加齢生物学教室ホームページ

    • URL

      http://www.shinshu-u.ac.jp/faculty/medicine/department/doctor/grdkarei/i-byotai/

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公開日: 2017-01-06  

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