ヒストンメチル化異常症の標的遺伝子探索と病態解明に基づく創薬基盤の確立

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26670169
• 研究機関: 佐賀大学
• 研究代表者: 副島 英伸 佐賀大学, 医学部, 教授 (30304885)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: ヒストンメチル化酵素 / 歌舞伎症候群 / ソトス症候群 / DNAメチル化

研究実績の概要

ヒストンメチル化関連酵素遺伝子の変異で発症する先天異常症候群には、H3K4メチル化酵素遺伝子KMT2DあるいはH3K27脱メチル化酵素遺伝子KDM6Aが原因である歌舞伎症候群（KS）とH3K36メチル化酵素遺伝子NSD1が原因であるソトス症候群（SoS）がある。これらのヒストン修飾とDNAメチル化は密接に関連することから、原因遺伝子変異のDNAメチル化への影響を調べるため、ゲノム中のインプリンティング関連DNAメチル化可変領域（DMR）のメチル化状態を解析した。KS 18例とSoS 21例の末梢血DNAを用いて、MALDI-TOF質量分析計により36ヵ所のDMRをスクリーニングし、異常メチル化を示したDMRについてbisulfite-pyrosequencingで確認した。KSでは2ヵ所のDMRで低メチル化、3ヵ所のDMRで高メチル化を認めたが、メチル化異常を示した症例の頻度は6-11％と低く、DMRのメチル化異常との関連性は低いと考えられた。一方、SoSでは8ヵ所のDMRで低メチル化を認め、特にDMR-Xでは71％、DMR-Yでは62％、DMR-Zでは48％の症例で低メチル化を認めた。そこで、DMR-Xの低メチル化に焦点を絞って解析を進めた。DMR-Xは遺伝子Aのプロモーター近傍に存在する。DMR-Xの配列はマウスとヒトで保存されているが、DNAメチル化状態は両者で異なるため、マウスを用いた実験はできない。そこで、ヒト染色体を一本保持しているCHO細胞を用いることとした。父由来染色体1本をもつCHO細胞と母由来染色体1本をもつCHO細胞のDMR-Xのメチル化を調べたところ、健常人と同様に親由来によってメチル化状態が異なるDMRを示していた。このことから、本細胞を用いて、DMR-Xのメチル化と遺伝子Aの発現との関連性について解析できることがわかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の研究目的では、ヒストンメチル化関連酵素遺伝子異常症としてKSのみを対象としていたが、同類の疾患としてSoSを加え解析した。まず、インプリントDMRのDNAメチル化状態を解析したところ、KSではンプリントDMRのメチル化異常との関連性は低いと考えられたが、SoSでは関連性が強く示唆された。そのため、SoSの解析を中心に行うこととした。SoSで最も高頻度にメチル化異常を示したDMR-Xに関してDNAメチル化異常と遺伝子発現の関連性については、ヒト染色体を一本保持しているCHO細胞を用いて実験できることがわかった。また、DMR-Xの範囲を決めるためにSNPがヘテロ接合であるヒト検体を用いてbisulfite-sequencingを行っており、結果が出つつある。さらに、共同研究でNsd1およびKmt2dのノックアウトマウスの作製が進行中であること、コンディショナル・ノックアウト用のflox ES細胞の作製が進行中であることから、おおむね順調に進展していると考えられる。

今後の研究の推進方策

SoSで最も高頻度にメチル化異常を示したDMR-Xについて、ヒト染色体を一本保持しているCHO細胞をDNA脱メチル化剤処理をすることでDNAメチル化異常と遺伝子発現の関連性を明らかにする。NSD1によるヒストンメチル化との関連性についても解析する。また、DMR-Xの範囲を決めるため、SNPがヘテロ接合であるヒト検体を用いてbisulfite-sequencingを行う。さらに、ルシフェラーゼアッセイ等によりDMR-Xがもつ遺伝子発現に関する機能を解析する。SoSで２番目に高頻度にメチル化異常を示したDMR-Yについても同様に解析を進める。
一方、KSについては、イルミナ社450Kビーズアレイを用いてKMT2D変異患者検体と正常コントロールと比較することにより、DNAメチル化異常部位を検出し、標的遺伝子を探索する。
さらに、共同研究により作製が進んでいるノックアウトマウスおよびflox ES細胞を入手し、標的遺伝子の探索による病態の解明を試みる。

次年度使用額が生じた理由

各種試薬の節約、効率的な使用方法により出費を抑えることができた。また、講座費等で一部分を賄った。

次年度使用額の使用計画

次年度は、主としてCHO細胞培養、DNAメチル化解析、遺伝子発現解析、ルシフェラーゼアッセイに必要な消耗品に研究費を充てる。その他、成果発表のための旅費、試料の運搬費、英文校正費に使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Autosomal recessive cystinuria caused by genome-wide paternal uniparental isodisomy in a patient with Beckwith-Wiedemann syndrome. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ohtsuka Y, Higashimoto K, Sasaki K, Jozaki K, Yoshinaga H, Okamoto N, Takama Y, Kubota A, Nakayama M, Yatsuki H, Nishioka K, Joh K, Mukai T, Yoshiura KI, Soejima H.
  • 雑誌名: Clin Genet 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1111/cge.12496
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Premature termination of reprogramming in vivo leads to cancer development through altered epigenetic regulation. (2014)
  • 著者名/発表者名: Ohnishi K, Semi K, Yamamoto T, Shimizu M, Tanaka A, Mitsunaga K, Okita K, Osafune K, Arioka Y, Maeda T, Soejima H, Moriwaki H, Yamanaka S, Woltjen K, Yamada Y.
  • 雑誌名: Cell 巻: 156 ページ: 663–677
  • DOI: org/10.1016/j.cell.2014.01.005
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Genome-wide parent-of-origin DNA methylation analysis reveals the intricacies of the human imprintome and suggests a germline methylation independent establishment of imprinting. (2014)
  • 著者名/発表者名: Court F, Tayama C, Romanelli V, Trujillo AM, Iglesias-Platas I, Okamura K, Sugahara N, Simón C, Moore H, Harness JV, Keirstead H, Sanchez-Mut JV, Kaneki E, Lapunzina P, Soejima H, Wake N, Esteller M, Ogata T, Hata K, Nakabayashi K, Monk D.
  • 雑誌名: Genome Res 巻: 24 ページ: 554-569
  • DOI: 10.1101/gr.164913.113
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] A novel de novo point mutation of the OCT-binding site in the IGF2/H19-imprinting control region in a Beckwith-Wiedemann syndrome patient. (2014)
  • 著者名/発表者名: Higashimoto K, Jozaki K, Kosho T, Matsubara K, Fuke T, Yamada D, Yatsuki H, Maeda T, Ohtsuka Y, Nishioka K, Joh K, Koseki H, Ogata T, Soejima H.
  • 雑誌名: Clin Genet 巻: 86 ページ: 539-544
  • DOI: 10.1111/cge.12318
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Comprehensive and quantitative multilocus methylation analysis reveals the susceptibility of specific imprinted differentially methylated regions (DMRs) to aberrant methylation in Beckwith-Wiedemann syndrome with epimutations. (2014)
  • 著者名/発表者名: Maeda T, Higashimoto K, Jozaki K, Yatsuki H, Nakabayashi K, Makita Y, Tonoki H, Okamoto N, Takada F, Ohashi H, Migita M, Kosaki R, Matsubara K, Ogata T, Matsuo M, Hamasaki Y, Ohtsuka Y, Nishioka K, Joh K, Mukai T, Hata K, Soejima H.
  • 雑誌名: Genet Med 巻: 16 ページ: 903-912
  • DOI: 10.1038/gim.2014.46
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Fibroadenoma in a Beckwith-Wiedemann syndrome with paternal uniparental disomy of chromosome 11p15.5. (2014)
  • 著者名/発表者名: Takama Y, Kubota A, Nakayama M, Higashimoto K, Jozaki K, Soejima H.
  • 雑誌名: Pediatr Int 巻: 56 ページ: 931-934
  • DOI: 10.1111/ped.12406
  • 査読あり
• [雑誌論文] Beckwith-Wiedemann症候群の臨床的研究―インプリント遺伝子解析と臨床経過を中心として― (2014)
  • 著者名/発表者名: 加藤大貴、井村英人、東元健、八木ひとみ、芝崎龍典、古川博雄、新美照幸、藤原 久美子、鈴木聡、外山佳孝、南克浩、井上知佐子、早川統子、副島英伸、夏目長門
  • 雑誌名: 日本口蓋裂学会雑誌 巻: 39 ページ: 21-27
  • DOI: doi.org/10.11224/cleftpalate.39.21
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Beckwith-Wiedemann症候群 (2014)
  • 著者名/発表者名: 東元健、副島英伸
  • 雑誌名: 周産期医学 巻: 44 ページ: 258-260
• [雑誌論文] 間葉性異形成胎盤Placental mesenchymal dysplasia (PMD)の診断と原因遺伝子 (2014)
  • 著者名/発表者名: 大場隆、片渕秀隆、副島英伸
  • 雑誌名: 病理と臨床 巻: 32 ページ: 535-540
• [学会発表] Small for gestational age（SGA）胎盤のゲノムワイドDNAメチル化解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 副島英伸、Rumbajan Janette Mareska、畑田出穂、中林一彦、泰健一郎、青木茂久、関博之、竹田省、城圭一郎
  • 学会等名: 日本人類遺伝学会第59回大会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2014-11-19 – 2014-11-22
• [学会発表] Genome-wide parent-of-origin DNA methylation analysis reveals the intricacies of the human imprintome and suggests a germline methylation independent control of imprinting in the placenta． (2014)
  • 著者名/発表者名: 中林一彦、Court Franck、田山千春、Romanelli Valeria、副島英伸、和氣徳夫、Esteller Manel、緒方勤、秦健一郎、Monk David．
  • 学会等名: 第8回日本エピジェネティクス研究会年会
  • 発表場所: 東京大学
  • 年月日: 2014-05-25 – 2014-05-27
• [学会発表] Ash1l methylates Lys36 of histone H3 independently of transcriptional elongation to counteract Polycomb silencing. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kenichi Nishioka、Hitomi Miyazaki, Ken Higashimoto, Yukari Yada, Takaho A. Endo, Jafar Sharif, Manabu Nakayama, Hidenobu Soejima, Haruhiko Koseki, Susumu Hirose．
  • 学会等名: 第8回日本エピジェネティクス研究会年会
  • 発表場所: 東京大学
  • 年月日: 2014-05-25 – 2014-05-27
• [学会発表] Beckwith-Wiedemann症候群と肝芽腫におけるmultiple methylation defectの解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 前田寿幸、Rumbajan Janette Mareska、東元 健、中林一彦、八木ひとみ、秦健一郎、城圭一郎、副島英伸．
  • 学会等名: 第8回日本エピジェネティクス研究会年会
  • 発表場所: 東京大学
  • 年月日: 2014-05-25 – 2014-05-27
• [学会発表] Beckwith-Wiedemann症候群における片親性父性ダイソミーの遺伝学多様性と臨床症状との関連 (2014)
  • 著者名/発表者名: 大塚泰史
  • 学会等名: 第69回佐賀小児科地方会
  • 発表場所: 佐賀大学
  • 年月日: 2014-04-05
• [学会発表] Beckwith-Wiedemann症候群におけるインプリントDMRのマルチローカスメチル化解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 前田寿幸
  • 学会等名: 第69回佐賀小児科地方会
  • 発表場所: 佐賀大学
  • 年月日: 2014-04-05
• [図書] エピジェネティクスの産業応用 第Ⅳ編疾患エピゲノム研究 第12章インプリンティング疾患のエピジェネティクス (2014)
  • 著者名/発表者名: 副島英伸
  • 総ページ数: 14
  • 出版者: シーエムシー出版
• [図書] Beckwith-Wiedemann症候群．別冊日本臨牀 新領域別症候群シリーズNo.29 神経症候群（第２版）Ⅳ-その他の神経疾患を含めて- (2014)
  • 著者名/発表者名: 東元健、副島英伸
  • 総ページ数: 4
  • 出版者: 日本臨牀社
• [図書] Silver-Russell症候群．別冊日本臨牀 新領域別症候群シリーズNo.29 神経症候群（第２版）Ⅳ-その他の神経疾患を含めて- (2014)
  • 著者名/発表者名: 前田寿幸、副島英伸
  • 総ページ数: 4
  • 出版者: 日本臨牀社
• [備考] 佐賀大学医学部分子生命科学講座分子遺伝学・エピジェネティクス分野
  • URL: http://www.biomol.med.saga-u.ac.jp/mbg/index.htm