| 研究課題/領域番号 |
26670217
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
池 郁生 独立行政法人理化学研究所, バイオリソースセンター, 専任研究員 (40183157)
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| 研究分担者 |
小久保 年章 独立行政法人放射線医学総合研究所, 研究基盤センター, 課長 (10425663)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | CARバチルス / グラム陰性菌 / 肺炎病原菌 / マウス / ラット / ゲノム編集 / 培養法改良 / 細胞付着機構 |
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| 研究実績の概要 |
CAR(Cilia Associated Respiratory、カー)バチルスはマウス・ラットの呼吸器線毛細胞に主に感染し慢性肺炎を起こすグラム陰性桿菌である(学名未定)。本菌は培養が困難であったが、我々は哺乳類培養細胞の上清を用いて本菌SMR株の液体培養に成功し、純培養した本菌のゲノムDNAを用いてCARバチルスの完全ゲノム配列を世界ではじめて決定した(全長1,439,084 bp、環状)。MiGAP等でゲノムを解析したところ約1,200のコード領域が推定されたが、その３分の１はNCBIなどの遺伝子配列データベースに対するBLAST検索にヒットしない機能未知のものであり、今のところ病原因子を始めとした多くの情報が不明である。本研究ではゲノム解析を進め、本菌遺伝子をターゲットに作成したカスタムマイクロアレイを使用して遺伝子発現を見ながら変異株を作成し、滑走運動をモデルに本菌の上皮細胞付着因子を決定することを目的とした。
平成２６年度は、まずゲノム情報の解析を進め、基本的なハウスキーピング遺伝子の発現状況のチェックを行なった。また、変異株作成のためのゲノム改変手法について再検討し、時間と労力がかかるトランスポゾン法をいったん中止して、CRISPR/Cas9を利用するゲノム編集法に変更することとし、CARバチルスの持つ酵素遺伝子の欠損株作成をトライアル候補(指示薬の発色変化により遺伝子欠損を推測可能)と決め、ゲノム編集方法の情報収集ならびにCas9ガイドRNA配列選択や遺伝子導入方法検討など実施準備を行なった。平行してゲノム編集後の本菌クローニングを効率よく行なうため、いままで誰も成功していない本菌の平板培養法の検討を開始し、現在、短期培養に成功するに至った。今後、本菌のゲノム編集および平板培養の技術改良を進め、平成２７年度中にCARバチルスの遺伝子欠損株作成法を確立し、Por分泌系遺伝子欠損株作成に進みたい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
CARバチルス変異株作成のためのゲノム改変手法について再検討し、CRISPR/Cas9を利用するゲノム編集法に変更したため、情報収集や実験デザイン制定に時間がかかり、計画に半年程度の遅れが見られる。しかし、ゲノム編集法を採用することにより効率よく遺伝子変異が導入でき、今後は変異株樹立までの時間短縮を見込むことができると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
CARバチルスの滑走運動分子欠損株作成のためのゲノム改変手法について、時間と労力がかかるトランスポゾン法をいったん中止して、CRISPR/Cas9を利用するゲノム編集法に変更することとした。まずゲノム編集法確立のためのトライアル候補遺伝子にCARバチルスの持つ酵素を選ぶ。本酵素はゲノム解析で存在が予測され、生化学試験により活性も確認した。基質を培地に加えると分解産物により培地中の指示薬の発色を変化させるので、遺伝子に欠損変異が導入されることによって生じる酵素機能不全を容易に検出可能である。発色反応により遺伝子欠損が推定された株については、当該遺伝子領域の塩基配列を決定して確認する。CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp)を用いてCas9のターゲット遺伝子候補を検索し、Local BLASTでCARバチルスのゲノム内に相同の遺伝子が無く、制限酵素認識配列を含むものを選ぶ。当該配列を用いてガイドRNAの設計を行なう。遺伝子欠損株のクローニングには、現在開発中の新規平板培養法、あるいは超低付着性培養器における液体培養中でCARバチルスが形成するシングルコロニー様アグリゲートのマイクロマニピュレーションクローニング法で行なう。トライアルが成功次第、Por分泌系遺伝子欠損株作成へ進みたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
CARバチルスの滑走運動分子欠損株作成のためのゲノム改変手法について再検討し、当初予定のトランスポゾン法をいったん中止してCRISPR/Cas9を利用するゲノム編集法に変更したため、情報収集や実験デザインに時間がかかり、必要な試薬等の購入が平成２６年度から平成２７年度にずれこんだ。
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| 次年度使用額の使用計画 |
CRISPR/Cas9関連およびガイドRNA作成関連試薬購入、菌の培養観察に必要な培養器や培地類の購入、遺伝子導入と発現解析に必要な分子生物学試薬類の購入等に用いる予定である。Cas9認識配列およびガイドRNA作成用のDNAは人工遺伝子で作成する。ガイドRNAはin vitroで転写して作成する。Cas9は酵素そのものを用いる。CARバチルスへのガイドRNAならびにCas9酵素の導入はエレクトロポレーションで行なう。
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