α-Cre相補とフレームオーバーラップ発現法の開発

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26670221
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 斎藤 泉 東京大学, 医科学研究所, 教授 (70158913)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: B型肝炎ウイルス / α相補 / HBV創薬 / 蛍光スクリーニング

研究実績の概要

本研究は当初の挑戦的計画をほぼ達成することができた。B型肝炎ウイルス（HBV）ゲノムは約3kbと小さく、また全ての遺伝子フレームがオーバーラップしているため本来はGFPやCre遺伝子を組み込むことはできない。しかしCre遺伝子を前半部分（α-Cre：0.5kb）と後半部分（β-Cre: 0.4kb）に分断し、両者を同時発現させるとCre活性を生ずる。またHBVのPreS1プロモーターから発現するPreS蛋白の領域（0.3kb）はP遺伝子とは異なるフレームを用いて発現しているが、HBVゲノム複製には不要である。本研究ではまず、このPreS蛋白のアミノ酸配を分断Creのアミノ酸配列に置き換えながらP遺伝子フレームを温存し、PreS1プロモーターから分断Creを発現するHBVゲノムを設計・構築した。そして他方の分断Creを外から過剰発現させることによりCre活性が得られるか検討した。その結果、作製した分断Creが確かにCre活性を生ずること、その活性によりGFP遺伝子の発現がonとなり、肝由来HuH細胞がGFPにより明瞭に蛍光を発することをトランスフェクションにより確認した。またHBVゲノム上のPreS1プロモーターからβ-Creを発現させた場合の方が、α-Creを発現させた場合よりも高い蛍光が得られることを見出した。HBVゲノム複製量を可視化測定できる方法が本研究により確立されたことにより、HBVゲノムの複製を阻止する薬剤の効率的スクリーニングに道が開かれたと考える。

研究成果

• [雑誌論文] Establishment of a tamoxifen-inducible Cre-driver mouse strain for widespread and temporal genetic modification in adult mice. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ichise H, Hori A, Shiozawa S, Kondo S, Kanegae Y, Saito I, Ichise T, Yoshida N.
  • 雑誌名: Experimental Animals 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1538/expanim.15-0126
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Single-domain Intrabodies against HCV Core Inhibit Viral Propagation and Core-induced NF-κB Activation. (2016)
  • 著者名/発表者名: Suzuki R, Saito K, Matsuda M, Sato M, Kanegae Y, Shi G, Watashi K, Aizaki H, Chiba J, Saito I, Wakita T, Suzuki T.
  • 雑誌名: Journal of General Virology 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1099/jgv.0.000423.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Preferable sites and orientations of transgene inserted in the adenovirus vector genome: the E3 site may be unfavorable for transgene position (2015)
  • 著者名/発表者名: Suzuki M., Kondo S., Pei Z., Maekawa A., Saito I. and Kanegae Y.
  • 雑誌名: Gene Therapy 巻: 22 ページ: 421-429
  • DOI: 10.1038/gt.2014.124
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Efficient production of the replicating HBV genome using "HBV-AdV System" (2015)
  • 著者名/発表者名: Suzuki M., Kondo S., Yamasaki M., Saito I., Shibasaki M. and Kanegae Y.
  • 学会等名: 2015 International Meeting Molecular Biology of Hepatitis B Viruses
  • 発表場所: Bad Nauheim Germany
  • 年月日: 2015-10-04 – 2015-10-08
  • 国際学会
• [学会発表] Multiplex guide RNAs targeting HBV genome expressed using adenovirus vector improve the efficiency of CRISPR/Cas9 system (2015)
  • 著者名/発表者名: Maekawa A., Kondo S., Suzuki M., Saito I. and Kanegae Y.
  • 学会等名: 2015 International Meeting Molecular Biology of Hepatitis B Viruses
  • 発表場所: Bad Nauheim Germany
  • 年月日: 2015-10-04 – 2015-10-08
  • 国際学会
• [備考] 東京大学医科学研究所遺伝子解析施設
  • URL: http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/idenshi/pg154.html