中枢神経症状を伴うリソソーム病患者由来iN細胞の誘導と神経変性制御機構の解明

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26670269
• 研究機関: 徳島大学
• 研究代表者: 伊藤 孝司 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (00184656)
• 研究分担者: 辻 大輔 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 助教 (00423400) ; 幾尾 真理子 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 特任助教 (60713401)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: ダイいレクトリプログラミング / 疾患iPS細胞 / induced Neuron (iN細胞） / リソソーム病 / 蛍光イメージング / トラフィッキング

研究実績の概要

リソソーム酵素の遺伝的欠損に基づき、脳内基質の過剰蓄積と中枢神経症状を伴うリソソーム病を対象に、ダイレクトリプログラミングによる患者由来皮膚線維芽細胞からinduced-Neuron（iN細胞）の誘導、または患者由来iPS細胞から運動ニューロン等の神経細胞を選択的に誘導する方法を確立し、基質蓄積過程等を検討することを目的として、研究を進めた。
1. ダイレクトリプログラミングによるヒト培養細胞株からのiN細胞の分化誘導に関しては、神経細胞誘導転写因子としてのヒトNeurogenin2（NGN2）またはSOX11の遺伝子発現用のトランスポゾン型piggyBacベクターを作製し、ヒトカテプシンA（CTSA）欠損症患者由来線維芽細胞株及びHEK293細胞への導入株を得た。
2. CTSA欠損症患者iPS細胞由来神経細胞の誘導については、京都大iPS細胞研の井上治久教授らの方法に従い、大脳皮質ニューロンへの誘導を検討し、Neurofiliment L陽性の神経細胞集団の獲得に成功し、同欠損症で同時欠損するNeuraminidase-1（NEU1）の活性低下に基づくと考えられる、末端α2,3-シアル酸含有糖鎖の蓄積が観察された。
3. 研究協力者の浦野らが開発した、酸性pH活性化蛍光プローブで標識した、哺乳類CHO細胞株由来改変型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼ（Hex）を、同酵素欠損症患者由来培養皮膚線維芽細胞株に投与したところ、細胞内に取り込まれ、リソソームマーカーと共局在する顆粒状の蛍光が観察され、リソソームへの輸送のイメージングは可能になった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究目的の一つである、ダイレクトリプログラミング法による皮膚線維芽細胞からの神経細胞（iN細胞）の誘導にはまだ成功していないが、中枢神経症状を伴うヒトカテプシンA（CTSA）欠損症患者iPS細胞由来大脳皮質ニューロンの分化誘導条件を確立し、末端α2,3-シアル酸認識抗体を用いる蛍光免疫染色法により、NEU1同時欠損に基づく患者由来ニューロンにおける末端シアル酸含有糖鎖の蓄積を初めて観察することに成功した。また酸性pH活性化プローブと組換えヒトリソソーム酵素とのコンジュゲートを、同酵素欠損症患者由来皮膚線維芽細胞株に投与した際に、リソソームへの輸送と局在化を観察できるようになったため。

今後の研究の推進方策

今後は、欠損症患者皮膚線維芽細胞からのiN細胞（神経細胞）細胞を誘導するために導入したNGN2及びSOX遺伝子を恒常発現する培養細胞株を樹立し、神経細胞誘導培地を用いて、コリン作動性ニューロンや運動ニューロンなどの機能性神経細胞への分化誘導を検討する。
また、得られたiN細胞や、患者iPS細胞由来大脳皮質ニューロンに対し、酸性pH活性化蛍光標識組換えリソソーム酵素を投与し、神経細胞内への取り込みとリソソーム内への輸送のイメージング法を確立するとともに、欠損酵素活性の回復と蓄積基質の減少との相関を解析し、治療効果の評価ができる疾患モデル系を構築していく。

研究成果

• [雑誌論文] In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology? (2014)
  • 著者名/発表者名: 1.Gallat, F.-X., Matsugaki, N., Coussens, N.P., Yagi, J.K., Boudes, M., Higashi, T., Tsuji, D., Tatano, Y., Suzuki, M., Mizohata, E., Tono, K., Hatui, Y., Yabashi, M., Nango, E., Itoh, K., Coulibaly, F., Tobe, S., Ramaswamy, S., Iwata, S. and Chavas, M. L.
  • 雑誌名: Philosophical Transactions of the Royal Society of London 巻: 369 ページ: 20130497
  • DOI: 10.1098/rstb.2013.0497
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Pim-2 kinase is an important target of treatment for tumor progression and bone loss in myeloma. (2014)
  • 著者名/発表者名: 2.Hiasa, M., Teramachi, J., Oda, A., Amachi, R., Harada, T., Nakamura, S., Miki, H., Fujii, S., Kagawa, K., Watanabe, K., Endo, I., Kuroda, Y., Yoneda, T., Tsuji, D., Nakao, M., Tanaka, E., Hamada, K., Sano, S., Itoh, K., Matsumoto, T. and Masahiro Abe, M.
  • 雑誌名: Leukemia 巻: 29 ページ: 207-217
  • DOI: 10.1038/leu.2014.147
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 組換えカイコを用いるネオグライコバイオロジクスの創製 (2015)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 孝司
  • 学会等名: 日本薬学会第135年会・一般シンポジウムS18「カイコを利用する創薬イノベーションと未来」
  • 発表場所: 神戸学院大学(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2015-03-26
  • 招待講演
• [学会発表] Development of protease－resistant modified human β-hexosaminidase B and evaluation of intracerebroventricular replacement effects on GM2 gangliosidosis model mice. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kitakaze, K., Tasaki, C., Mizutani,Y. Sugiyama, E., Ikuo, M., Kamiya, M., Setou, M., Urano, Y. and Itoh, K.
  • 学会等名: The 11th Annual World Symposium
  • 発表場所: Hyatt Regency Orlando（USA,Orlando）
  • 年月日: 2015-02-10
• [学会発表] Galactosialidosis 患者由来iPS 細胞の樹立と中枢神経系モデルの構築 (2014)
  • 著者名/発表者名: 今滝 泉, 辻 大輔, 櫻庭 均, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第53回日本薬学会・日本薬剤師会・日本病院薬剤師会 中国四国支部学術大会
  • 発表場所: 広島国際会議場(広島県広島市)
  • 年月日: 2014-11-09
• [学会発表] 改変型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼの分子特性解析とGM2蓄積症モデル細胞への補充効果 (2014)
  • 著者名/発表者名: 水谷 安通, 北風 圭介, 田崎 智佳子, 櫻庭 均, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都府京都市）
  • 年月日: 2014-10-18
• [学会発表] 改変U1 snRNAによるヒトカテプシンAの遺伝子発現におけるスプライシング異常の修復 (2014)
  • 著者名/発表者名: 池 啓伸, 山﨑 尚志, 田中 翔子, 金澤 慶祐, 滝口 祥令, 南川 典昭, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第87回日本生化学会
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都府京都市）
  • 年月日: 2014-10-18
• [学会発表] Galactosialidosis患者由来iPS細胞の樹立及び中枢神経系細胞への分化誘導 (2014)
  • 著者名/発表者名: 今滝 泉, 辻 大輔, 櫻庭 均, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都府京都市）
  • 年月日: 2014-10-18
• [学会発表] GM2蓄積症モデルマウスに対する改変型ヒトβーヘキソサミニダーゼの有効性評価 (2014)
  • 著者名/発表者名: 北風 圭介, 田崎 智佳子, 水谷 安通, 杉山 栄二, 神谷 真子, 瀬藤 光利, 浦野 泰照, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都府京都市）
  • 年月日: 2014-10-18
• [学会発表] 改変型ヒトβ- Hexosaminidase のGM2 蓄積症モデルに対する治療効果の評価 (2014)
  • 著者名/発表者名: 北風 圭介, 田崎 智佳子, 水谷 安通, 杉山 栄二, 神谷 真子, 瀬藤 光利, 浦野 泰照, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第5回グライコバイオロジクス研究会
  • 発表場所: 富山国際会議場（富山県富山市）
  • 年月日: 2014-09-20
• [学会発表] GM2蓄積症の新規治療薬開発を目指した機能改変型ヒトβーヘキソサミニダーゼの作製と評価 (2014)
  • 著者名/発表者名: 北風 圭介, 田崎 智佳子, 水谷 安通, 神谷 真子, 浦野 泰照, 伊藤 孝司
  • 学会等名: 第55回日本生化学会 中国・四国支部例会
  • 発表場所: 愛媛大学城北キャンパス(愛媛県松山市）
  • 年月日: 2014-06-12
• [学会発表] 改変U1snRNAによるヒトカテプシンAスプライス異常修復の試み (2014)
  • 著者名/発表者名: 山﨑 尚志, 田中 翔子, 金澤 慶祐, 伊藤 孝司, 南川 典昭, 滝口 祥令
  • 学会等名: 第55回日本生化学会 中国・四国支部例会
  • 発表場所: 愛媛大学城北キャンパス(愛媛県松山市）
  • 年月日: 2014-06-12
• [学会発表] 中枢神経変性を伴うリソソーム病に対する脳指向性治療薬と新規評価系の開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 孝司
  • 学会等名: Biotech2014
  • 発表場所: 東京ビックサイト(東京都江東区)
  • 年月日: 2014-05-15
  • 招待講演
• [学会発表] リソソーム病に対するiPS創薬を目指して―神経難病患者由来iPS細胞の病態解明・治療法開発への応用― (2014)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 孝司
  • 学会等名: 京都大学iPS細胞研究所 井上治久研究室セミナー
  • 発表場所: 京都大学（京都府京都市）
  • 年月日: 2014-05-08
  • 招待講演
• [図書] 別冊日本臨牀 新領域別症候群(第2版)Ⅳ (2014)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 孝司
  • 総ページ数: 5(320-324)
  • 出版者: 日本臨牀社
• [図書] 別冊日本臨牀 新領域別症候群(第2版)Ⅲ (2014)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 孝司
  • 総ページ数: 4(796-799)
  • 出版者: 日本臨牀社
• [備考] 徳島大学大学院医歯薬研究部・創薬生命工学分野ホームページ
  • URL: http://www.tokushima-u.ac.jp/ph/faculty/labo/btc/