アレルギー性疾患の先制医療を目指して：アトピー性皮膚炎における鼻腔常在菌叢の意義

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26670275
• 研究機関: 浜松医科大学
• 研究代表者: 前川 真人 浜松医科大学, 医学部, 教授 (20190291)
• 研究分担者: 戸倉 新樹 浜松医科大学, 医学部, 教授 (00172156)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: アトピー性皮膚炎 / 黄色ブドウ球菌 / 皮膚常在菌 / 鼻腔常在菌叢 / マイクロバイオーム / 先制医療

研究実績の概要

健常人ボランティアを対象として、肘窩皮膚から綿棒で擦ってDNA回収液に回収する方法（QuickExtract DNA Extraction Solution、エピセンター社）、粘着式のテープ（毛穴すっきりパック、ビオレ社）で毛穴から角栓を回収する２つの方法を試み、回収した溶液からエタノール沈殿でDNAを抽出した。また、回収した溶液からキアゲンのDNA抽出試薬（QIAmpマイクロキット、キアゲン社）でDNA精製した。DNA量をナノドロップ、Qubitで測定したところ、前者では数字はでるものの260 nmにピークはなく、Qubitによる定量では非常に小さな値となった。すなわち、DNA回収量が小さかった。ヒトDNAを増幅するプライマー、細菌の16SリボゾームRNA（rRNA）遺伝子を増幅するプライマーでPCRを行ったところ、QUBITの測定値が信頼できることは判明したが、やはりDNA量として多くなかった。既報も参考に、適正な検体採取法、DNA抽出法を選択し、アトピー性皮膚炎患者から無駄なく検討用試料を得て本番のマイクロバイオーム解析に持ち込める系を確立させていく。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

年度途中からのマンパワーの減少があったこと。皮膚から常在菌由来のDNAを採取する方法を確立するために、健常人ボランティアを対象として、綿棒で擦る、粘着式のテープで毛穴から角栓を回収するなどの方法を試み、さらにキアゲンのキットなどを使用してDNAを抽出しているが、得られるDNA量が少なくDNA採取条件の構築が完成していないこと。以上の２点のため、その先にまだ進んでいない。アトピー性皮膚炎の患者の皮膚は健常人よりさらにドライなので、健常人で確実にDNA抽出できる系を確立した後に、患者から適切に検体採取を行えるよう、さらなる条件設定を行って本番に進めていきたいと考える。
アトピー性皮膚炎患者の検体を採取することに関しては、倫理委員会で既に承認を得ている。16SリボゾームRNA（rRNA）遺伝子の配列多型を用いて解析するために、V4領域周辺の保存性の高い領域にプライマーを設定し、MiSeqシステム（イルミナ社）を用いて150塩基のペアエンド解析を行う試薬などの準備は進んでいる。

今後の研究の推進方策

マイクロバイオーム解析を可能とするために、患者皮膚から適切にDNAを採取する方法を確立した後、アトピー性皮膚炎の好発部位である肘窩を検体採取部位として、皮疹の増悪前、増悪後、治療後の時点で、皮膚から検体を採取する。また、同時に鼻腔の常在菌も綿棒によって採取する。そこからDNAを抽出し、16SリボゾームRNA（rRNA）遺伝子の配列多型を用いて解析する。すなわち、16S rRNA遺伝子の４番目の超可変領域（V4）をシーケンスするために、V4領域周辺の保存性の高い領域にプライマーを設定し、MiSeqシステム（イルミナ社）を用いて150塩基のペアエンド解析を行う。その結果を元にマイクロバイオーム解析を行い、菌種のプロファイルを比較する。
皮膚、鼻腔のスワブ、綿棒を通常の血液寒天培地、BTB培地、黄色ブドウ球菌選択培地で塗抹・培養し、通常の微生物検査と同じ流れで、微生物検査学的に各細菌の同定・感受性試験を行い、最も優勢な菌を同定し、同一患者の皮膚と鼻腔でその性状の分子生物学的および微生物検査学的に比較検討を行う。そのために、DiversiLabによる遺伝型タイピング検査、全ゲノムシーケンスを行い、相同性を評価する。

次年度使用額が生じた理由

１１の項に記した理由により研究の遂行が遅れ、予定よりも試薬消耗品の使用が少なくなり、研究費を使用せずに次年度に回すこととなったため。

次年度使用額の使用計画

今後の推進方策に記載したように実験を進めることで、遅れている分も使用していく予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Pustular psoriasis-like lesions associated with hereditary lactate dehydrogenase M subunit deficiency without interleukin-36 receptor antagonist mutation: long-term follow-up of two cases. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ito T , Aoshima M, Sugiura K, Fujiyama T, Ito N, Sakabe JI, Akiyama M, Maekawa M, Tokura Y
  • 雑誌名: Br J Dermato 巻: Epub ページ: Epub
  • DOI: 10.1111/bjd.13590.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Recommended use of Cut-off Folate Concentration in Serum and Erythrocyte(Red Blood Cell) as Expressed by Folic Acid Equivalent for the Diagnosis of Deficiency in Deliberating the Creation on Dietary Reference Intakes. (2015)
  • 著者名/発表者名: Ihara H, Hirota K, Watanabe T, Totani M, Hashizume N, Aoki Y, Nagashima Y, Kamioka K, Onda K, Sunahara S, Suzuki T, Itabashi M, Ishibashi M, Ito S, Ohashi K, Ohta Y, Nobori T, Fujishiro K, Maekawa M, Miura M, Miyano H, Ando T, Nishimura K
  • 雑誌名: Austin J Nutri Food Sci 巻: 3(1) ページ: 1055-1056
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] HbA1c NGSP値のサーベイ。 (2015)
  • 著者名/発表者名: 村上正巳、柏木厚典、武井 泉、雨宮 伸、石橋みどり、植木浩二郎、佐藤麻子、永峰康孝、前川真人、矢冨 裕
  • 雑誌名: 糖尿病 巻: 58(1) ページ: 45-50
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Final height and cardiometabolic outcomes in young adults with very low birth weight (< 1500 g). (2014)
  • 著者名/発表者名: Sato R, Maekawa M, Genma R, Shirai K, Ohki S, Morita H, Suda T, Watanabe H
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 9(11) ページ: 1-9
  • DOI: 10.1371/ journal.pone.0112286
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] National Institute of Standards and Technorogy SRM 972 as a reference material for serum total 25-hydroxyvitamin D measurements. (2014)
  • 著者名/発表者名: Ihara H, Hirota K, Miura M, Kitajima I, Yamashita M, Nomura F, Nishimura M, Totani M, Hashizume N,Aoki Y, Nagashima Y, Kamioka K, Onda K, Sunahara S, Suzuki T, Itabashi M, Ishibashi M, Ito S, Ohashi K, Ohta Y, Nobori T, Fujishiro K, Maekawa M, Miyano H, Ando T, Nishimura K, Tsugawa N, Okano T
  • 雑誌名: Int Anal Bio-Sci 巻: 2(1) ページ: 1-6
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Plasma connective tissue growth factor levels as potential biomarkers of airway obstruction in patients with asthma. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kato M, Fujisawa T, Hashimoto D, Kono M, Enomoto N, Nakamura Y, Inui N, Hamada E, Miyazaki O, Kurashita S, Maekawa M, Suda T
  • 雑誌名: Ann Allergy Asthma Immunol 巻: 113(3) ページ: 295-300
  • DOI: 10.1016/j.anai.2014.05.026
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Usual interstitial pneumonia preceding collagen vascular disease: a retrospective case control study of patients initially diagnosed with idiopathic pulmonary fibrosis (2014)
  • 著者名/発表者名: Kono M, Nakamura Y, Enomoto N, Hashimoto D, Fujisawa T, Inui N, Maekawa M, Suda T, Colby TV, Chida K
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 9 ページ: e94775
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0094775
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] IgG4-related skin disease. (2014)
  • 著者名/発表者名: Tokura Y, Yagi H, Yanaguchi H, Majima Y, Kasuya A, Ito T, Maekawa M, Hashizume H
  • 雑誌名: Br J Dermatol. 巻: 171 ページ: 959-967
  • DOI: 10.1111/bjd.13296.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cell line differences in replication timing of human glutamate receptor genes and other large genes associated with neuraldisease. (2014)
  • 著者名/発表者名: Watanabe Y, Shibata K, Maekawa M
  • 雑誌名: Epigenetics 巻: 9 (10) ページ: 1350-1359
  • DOI: 10.416/ 15592294.2014.967585
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 臨床検査医学 アルブミン測定、BCP改良法とBCG法による測定値 (2014)
  • 著者名/発表者名: 前川真人
  • 雑誌名: 医学のあゆみ 巻: 251(2) ページ: 182-183
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] 骨型ALP測定法。 (2014)
  • 著者名/発表者名: 下田 綾、前川真人
  • 雑誌名: 検査と技術 巻: 42(13) ページ: 1382-1388
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] 血清酵素検査で見出された異常データの電気泳動解析。 (2014)
  • 著者名/発表者名: 前川真人
  • 雑誌名: 臨床病理 巻: 62(11) ページ: 1088-1093
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Analytical evaluation of third-generation allergen-specific IgE assay “3gAllergyTM” Measurement by Automated Immunoassey System “IMMULITE 2000XPi”. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hamada E, Maekawa M
  • 学会等名: AACC 2014 Annual Meeting& Clinical Lab Expo
  • 発表場所: McCormic Place Convention Center, Chicago USA
  • 年月日: 2014-07-27 – 2014-07-31
• [学会発表] A case of prostate cancer producing granulocyte colony- stimulating factor. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hamada E,Takayama T, Ozono S, Maekawa M
  • 学会等名: IFCC Worldlab Istanbul 2014
  • 発表場所: Istanbul Congress Center, Istanbul Turkey
  • 年月日: 2014-06-22 – 2014-06-26
• [図書] 臨床検査データブックLABDATA2015-2016 (2015)
  • 著者名/発表者名: 青沼和隆、青野敏博、秋山雄次、浅川明弘、阿部好文、天谷雅行、新井祐子、荒木拓也、荒木靖人、安藤雄一、安東由喜雄、飯高 誠、飯塚 誠、伊賀立二、五十嵐 隆、伊苅裕二、池森敦子、石井 彰、石井恵子、前川真人
  • 総ページ数: 1059 (646-672)
  • 出版者: 医学書院
• [図書] 臨床検査ガイド2015改訂版 (2015)
  • 著者名/発表者名: 福井次矢、斧 康雄、三嶋理晃、島田和幸、深澤 浩、奥新和也、小池和彦、廣田衛久、下瀬川 徹、五十嵐雅彦、丹治泰仁、野村 隆、三橋知明、工藤 工、伊藤 充、黒川峰夫、南谷泰仁、鈴木勝也、竹内 勤、前川真人
  • 総ページ数: 1154 (123-126)
  • 出版者: 文光堂
• [図書] 引いて調べる先天代謝異常症 (2014)
  • 著者名/発表者名: 青山友佳、市本景子、伊藤哲哉、伊藤 康、碓井ひろみ、大竹 明、大橋十哉、小川絢子、小国弘量、小沢 浩、折居建治、梶 俊策、加藤淳二、窪田 満、呉 繁夫、顧 艶紅、古賀靖敏、小須賀基道、児玉浩子、前川真人
  • 総ページ数: 175 (57)
  • 出版者: 診断と治療社
• [図書] パーフェクトガイド検査値事典第2版 (2014)
  • 著者名/発表者名: 高木 康、〆谷直人、野村文夫、澤部祐司、吉田俊彦、清宮正徳、梅村啓史、戸塚 実、日野田裕治、杉浦哲郎、高橋延行、橋本直明、光井 洋、池田 均、中川勇人、高橋伯夫、渡辺 毅、浅井 淳、飯野和美、前川真人
  • 総ページ数: 707 (95-104)
  • 出版者: 総合医学社