研究課題/領域番号 |
26670365
|
研究機関 | 大阪大学 |
研究代表者 |
樂木 宏実 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20252679)
|
研究分担者 |
中神 啓徳 大阪大学, その他の研究科, 教授 (20325369)
鷹見 洋一 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (90621756)
|
研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
キーワード | 老化 / ユビキチンシステム / 血管内皮障害 |
研究実績の概要 |
ユビキチンシステムに関連する分子機能の異常は酸化ストレスや小胞体ストレスによる細胞老化を促進し、様々な加齢性疾患への関与が想定される。本研究では、老化に伴う心血管疾患の進展において中心的な役割を担う血管内皮障害を鋭敏に反映するバイオマーカーやその病態に関連する創薬標的分子について血管内皮におけるユビキチン系関連分子に焦点を絞り探索、機能解析し、最終的には確かな情報を有する疫学研究を用いて臨床応用の可能性を検証することを目的とする。 解析対象とするユビキチン関連分子の選定に際し、HVJ-Eベクターを用いた遺伝子機能スクリーニング法を用いた。先ず、老化に関連する遺伝子を得るためにHUVEC(ヒト臍帯静脈内皮細胞)の継代を繰り返し、senescenceを認めた段階でRNAを抽出した。そして、抽出したRNAをcDNA化し、発現ベクターに挿入されたcDNAライブラリーを作成した。実際の遺伝子機能スクリーニングでは、臨床サンプルを用いた将来的な臨床研究を念頭において、解析対象分子を液性因子またはその発現を調節する分子とするために共培養の系を用いることとした。具体的には24wellプレート4枚を用いて、作成したライブラリーをHVJ-Eベクターを用いて遺伝子導入したBHK-21細胞をupper chamberに、HUVECをlower chamberに共培養しH2O2で刺激し、24時間後にHUVECのβgal活性を測定した。その中で、最も高い活性を示したもの(細胞老化が促進)、最も低い活性を示したもの(細胞老化が抑制)に対応するwellのBHK-21細胞よりDNAを抽出し、大腸菌に形質転換することで、プラスミドを単離し、現在、挿入された遺伝子配列を解析中である。解析対象とする候補遺伝子は、ユビキチン系分子で液性因子であるものを選択する予定である。
|
現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究を担当している大学院生が基礎研究の初心者であったため、基本的な技術習得をするのに一定の時間を要したことと今回の遺伝子機能スクリーニングの予備実験、HUVECのcDNAライブラリーの作成に予想以上の時間を要したことが理由である。
|
今後の研究の推進方策 |
前記、研究実績に記した老化促進または抑制機能をもつ可能性のある遺伝子について、個々にBHK-21細胞に遺伝子導入し、H2O2刺激下にHUVECと共培養することで2次スクリーニングを施行し、老化促進または老化抑制因子を選出する。解析候補遺伝子が多数ある場合には文献探索ソフトKeyMolnet を用いて血管でのユビキチンシステムを軸としたネットワーク解析を行い、本研究にて解析対象とするユビキチン系関連分子を機能性標的分子と推測される分泌蛋白を含む様に2~3 個に絞り込み、決定する。
|