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申請者らは平成26年度に2種類の新規低分子ペプチドを同定しており、マウス胎仔肝臓造血幹細胞にペプチドを添加培養することにより細胞増殖が抑制される一方で、造血前駆細胞分画が増加することを明らかにている。また平成27年度には、ヒトの細胞を用いたin vitro機能解析、ペプチドの作用機序解明、造血幹細胞制御法開発への応用可能性の検討を行った。ヒトの細胞に対する新規ペプチドの作用を評価するため、ヒト臍帯血造血幹細胞を増加させる既知のペプチドを用いて培養条件の最適化を行った。将来的な橋渡し・臨床研究への発展を見据えて、当初使用を予定していた培地から、無血清かつ動物由来成分不含の培地へと変更し、細胞内へのペプチド取り込み、培養後の生細胞数、ヒトCD34陽性CD38陰性造血幹細胞分画の細胞数、コロニー形成能、遺伝子発現の評価を行い、培養条件の最適化を完了した。平成28年度には低分子ペプチドの作用機序を明らかにするため、下流シグナルの解析を行った。低分子ペプチドと相互作用・結合する因子を同定するため、ビオチン標識した低分子ペプチドを造血細胞へ取り込ませた後、細胞からタンパク質を抽出し、抗ビオチン抗体を用いて免疫沈降を行った。得られた免疫沈降物で得られた結合タンパク質をLC-MS/MSで解析した。その結果、ペプチド添加条件のみに存在する候補因子を10種類選出した。候補因子に関して、real-time PCR法による遺伝子発現のvalidationの結果、下流シグナル因子2種を発見した。ヒト造血幹細胞を用いて以上の検討により選出したシグナルの発現抑を行い、低分子ペプチドと共に培養して、増殖数とコロニー形成能を解析した。その結果、低分子ペプチド下流シグナルの発現を抑制することで、ペプチド添加による細胞増殖能力とコロニー形成能の低下がみられた。
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