研究課題
申請者は単一の転写因子ETV2を導入する「細胞直接リプログラミング法」によりヒト成人皮膚線維芽細胞を機能的な血管内皮細胞に直接転換できることを報告した（PNAS 2015）。この中でETV2が皮膚線維芽細胞中に恒常的に発現しているFOXC2と共役的に作用することが直接転換に必須であることを明らかにした。一方、造血幹細胞と血管内皮細胞は共にhemogenic endotheliumという胎生期にのみ存在する特殊な血管内皮細胞より発生する。加えて、私達はヒト成人皮膚線維芽細胞が血球分化に重要な転写因子GATA2を恒常的に発現していることを見出した。そこで、本研究では、１）「ETV2と他の転写因子を組み合わせることでヒト成人皮膚線維芽細胞からhemogenic endotheliumの誘導が可能」２）「このhemogenic endotheliumを経ることによりヒト成人皮膚線維芽細胞から機能的なT細胞を分化誘導できる」と仮説し、血球分化に重要な30種類の候補転写因子のレンチウイルス発現ベクターを作成した。ETV2及びこれら30種類の転写因子をヒト成人皮膚線維芽細胞に導入し、OP9ストローマ細胞と共培養したところ、遺伝子導入12日後に汎血球マーカーCD43/CD45陽性細胞が出現した（１-２％）。この細胞のゲノムDNAを分離しゲノムに組み込まれている転写因子をPCRにより探索したところ、ETV2を含む22種類の因子が検出された。この結果はCD43/CD45陽性細胞が非常にヘテロな細胞集団であり、培養系をよりT細胞に特化させることでT細胞を誘導できることを示唆している。そこでIL-7存在下でNOTCHリガンドDLL1を安定発現しているOP9-DL1細胞と共培養したところ、CD3陽性細胞が出現することを見出した（２-３％）x
2: おおむね順調に進展している
線維芽細胞からCD3陽性細胞を誘導できた。
線維芽細胞由来のCD3陽性細胞からゲノムDNAを分離しゲノムに組み込まれている転写因子をPCRにより探索する。この成果を線維芽細胞にフィードバックすることにより、T細胞誘導因子を決定する。更に、本方法で誘導されたT細胞の機能をIn vitroおよびNOD SCIDマウスに移植しin vivoで評価する。
当初の予想より早くCD3陽性細胞を得ることができ、サイトカイン・増殖因子・培地の使用量を減らすこととなった。
余剰分は当初の実験計画に加え、in vivoアッセイに重点を置くためにより多くのNOD SCIDマウスの購入に当てる。
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Proc Natl Acad Sci U S A
巻: 112 ページ: 160-165
10.1073/pnas.1413234112
