| 研究課題/領域番号 |
26670478
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| 研究機関 | 福島県立医科大学 |
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研究代表者 |
関根 英治 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (40363759)
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| 研究分担者 |
町田 豪 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (80583632)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 補体 / 第二経路 / レクチン経路 / MASP-1/3 / MAp44 |
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| 研究実績の概要 |
①MASP-1/3遺伝子ノックアウトのC57BL/6マウスにリコンビナントMASP-1/3を免疫し、モノクローナル抗体の作製を試みたが、MASP-1/3に対する抗体は産生されなかった。その理由として、MASP-1/3遺伝子のノックアウト部位をスキップして、MASP-1/3遺伝子ノックアウトマウスでもMASP-1/3の微量タンパクが産生され、これが免疫寛容を誘導してしまったためと考えられた。
②MASP-1/3を阻害する融合タンパクMAp44-Igの開発
C57BL/6マウスの心臓、肝臓からtotal RNAを抽出し、RT-PCRでMAp44のDNA配列を増幅、大腸菌でクローニングしvector pFUSE-IgG1-Fc1にMAp44遺伝子を組み込んでCHO細胞にTransfectionした。MAp44-Ig融合タンパクの産生を確認し、4M NaCl条件下でPritein Aによる免疫沈降法にて融合タンパクの回収を行った。融合タンパクの機能解析として、mannan coat plateでのC3 deposition、C4 depositionが阻害されるか検証したところ、いずれも融合タンパクを加えるとdepositionが増加してしまい、逆に補体が活性化されてしまう結果となった。
③MASP-1/3を阻害する融合タンパクMAp44-PAの開発
MAp44-Igで補体が活性化された結果であったため、IgG1の影響の可能性を考え別のtagを有するvectorで再度MAp44の融合タンパクを作成した。pFUSE-IgG1-Fc1に組み込んだMAp44のDNA配列を制限酵素で切り出し、vector pCAG-Bsd PA tag-Cへ組み込んだ。PA tagに対するaffinity chromatographyで融合タンパクを回収した。MAp44-PA融合タンパクはmannan coat plateでのC3 deposition阻害作用が確認された。現在、融合タンパクを量産しさらに解析中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初予定した、抗MASP-1/3モノクローナル抗体と、MASP-1/3を阻害する融合タンパクMAp44-Igの開発がうまくいかなかったため、新たにPA-tagを付加したMAp44-PAを開発し、 vitroの検査でのパイロットスタディーでは、MAp44-PAによるレクチン経路の阻害作用が確認されたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初予定した、抗MASP-1/3モノクローナル抗体と、MASP-1/3を阻害する融合タンパクMAp44-Igの開発がうまくいかなかったため、新たにPA-tagを付加したMAp44-PAを開発した。
パイロットスタディーでは、in vitroの検査でMAp44-PAによるレクチン経路の阻害作用が確認された。第二経路の阻害作用の有無の検討を行うため、現在、MAp44-PAタンパクを量産しさらに解析中を進める予定である。
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