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①FGFR3遺伝子安定発現NSCの樹立：クローニングしたFGFR3遺伝子が、野生型、K650E変異型、R248C変異型であることを確認し、レンチウイルスによる遺伝子発現法を用いて、ZsGreen蛍光蛋白標識を指標にセルソータにて分取し、FGFR3安定発現NSCラインを樹立した。NSCに導入されたFGFR3の発現および活性化状態を調べた結果、FGFR3野生型および変異型蛋白の発現レベルは同等であったが、FGFR3シグナリングの下流シグナル分子のリン酸化状態にライン間で差異を認めた。
②NSC由来in vitro大脳様オルガノイド（ミニブレイン）作製法の樹立：我々が材料に用いているNSCは多能性幹細胞と比較して既にステージが進んでいるため、培養液組成、細胞外基質、培養環境の全てにおいて改良を加える必要があった。未発表のため詳細は示さないが、特殊環境下にてNSCからミニブレイン様の構造体を作製するに至った。ミニブレインから切片を作製し、免疫染色で細胞マーカーを検討した結果、神経細胞に分化した層とグリア細胞に分化した層がある規則性をもって区画化された状態で構造体を造り上げている像が捉えられた。また、細胞体を豊富に含む領域と細胞外成分で満たされた領域が存在した。今後の発展研究においてさらなる改良を加えることでより良い方法論の確立と疾患病態モデルの作製に至ると考えられる。
③in vitro TDモデルの作製への試み：TDミニブレインモデルの作製は、ヒトNSCの倍加スピードが遅いことも相まって複数回の施行には至っておらず、有意義な再現性のある結果を本報告書に記載することはできない。将来的な発展研究として、変異型FGFR3を発現させたNSCから作製したミニブレインに関して、遺伝子発現解析や細胞分化マーカーによる性質決定を行うことで、TD病態の理解に繋がるものと考えられる。
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