部位特異的制限酵素I-PpoIを応用したPCRによる染色体転座検出法の開発

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26670549
• 研究機関: 群馬大学
• 研究代表者: 柴田 淳史 群馬大学, 先端科学研究指導者育成ユニット, 助教 (30707633)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: DNA修復 / 染色体転座 / ゲノム不安定性

研究実績の概要

二次発がんを導く重篤な突然変異として染色体転座がある。転座はDNA二本鎖切断後に導かれるが、転座発生までのステップは複雑であり様々なDNA修復因子が関わるため、患者の遺伝的背景からその予測をすることは極めて困難である。一方、現在主流の放射線誘発染色体転座を検出する方法は、熟練した技術が必要であり測定完了まで数日を要する。本研究ではPCRを用いた新染色体転座検出系を開発することで、細胞内における放射線誘発染色体転座頻度を簡便かつ短時間に予測する方法の確立を目指す。本研究では転座発生原因となる放射線照射誘発DNA二本鎖切断（DSB)を模倣且つ制御するために、15bpと長い認識配列を有するゲノム内在性制限酵素I-PpoIを用いる。
本年度は全細胞集団においてI-PpoIを同時期に誘発するため、細胞はタモキシフェン誘導体4-OHT(4-hydroxytamoxifen)で誘導可能なI-PpoI-U2OS細胞の作成および樹立を試みた。しかしながらER-I-Ppo1を発現するU2OS細胞でのDSBの切断が認められなかった。そのため、昨年度まで使用したI-PpoI-HT1080細胞を使い、1000 nM 4-OHT処理後のrDNA部位での転座頻度をPCRにより測定したが、4種類の転座の組み合わせの全てで転座の発生はほとんど確認出来なかった。他染色体実験による放射線照射後の転座頻度を上昇させるATM阻害剤およびDNA-PK阻害剤の処理も試みたが、I-Ppo1によって誘発されるrDNA部位での転座はほとんど観察されなかった。qPCRにより切断効率を確認した結果、約30-50%のみが切断されていたため、今後の課題として切断効率を上げる方法の確立が必要であると考えられた。

研究成果

• [雑誌論文] Regulation of pairing between broken DNA-containing chromatin regions by Ku80, DNA-PKcs, ATM, and 53BP1. (2017)
  • 著者名/発表者名: Motohiro Yamauchi, Atsushi Shibata, Keiji Suzuki, Masatoshi Suzuki, Atsuko Niimi, Hisayoshi Kondo, Miwa Miura, Miyako Hirakawa, Keiko Tsujita, Shunichi Yamashita, Naoki Matsuda.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 7 ページ: 41812
  • DOI: 10.1038/srep41812
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] BRCA1 directs the repair pathway to homologous recombination by promoting 53BP1 dephosphorylation. (2017)
  • 著者名/発表者名: Mayu Isono, Atsuko Niimi, Takahiro Oike, Yoshihiko Hagiwara, Hiro Sato, Ryota Sekine, Yukari Yoshida, Shin-Ya Isobe, Chikashi Obuse, Ryotaro Nishi, Elena Petricci, Shinichiro Nakada, Takashi Nakano and Atsushi Shibata.
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 18(2) ページ: 520-532
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2016.12.042
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Identification of DNA double strand breaks at chromosome boundaries along the track of particle irradiation. (2016)
  • 著者名/発表者名: Atsuko Niimi, Motohiro Yamauchi, Siripan Limsirichaikul, Ryota Sekine, Takahiro Oike, Hiro Sato, Keiji Suzuki, Kathryn D. Held, Takashi Nakano, and Atsushi Shibata
  • 雑誌名: GENES CHROMOSOMES & CANCER 巻: 55(8) ページ: 650-660
  • DOI: 10.1002/gcc.22367
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [学会発表] DNA repair pathway regulates PD-L1 expression in cancer cells. (2017)
  • 著者名/発表者名: 柴田淳史
  • 学会等名: International Symposium on Immune Diversity and Cancer Therapy Kobe 2017
  • 発表場所: 神戸ポートピアホテル(兵庫県・神戸市)
  • 年月日: 2017-01-26 – 2017-01-28
  • 国際学会
• [学会発表] DNA二本鎖切断修復経路の選択性を担う時空間的制御機構 (2016)
  • 著者名/発表者名: 柴田淳史
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(神奈川県・横浜市)
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] 重粒子線特異的なDNA 損傷の可視化と修復経路への影響 (2016)
  • 著者名/発表者名: 柴田淳史
  • 学会等名: 放射線医学総合研究の第２回放射線がん生物研究セミナー
  • 発表場所: 放射線医学総合研究所(千葉県・千葉市)
  • 年月日: 2016-11-15
  • 招待講演
• [学会発表] シンポジウム「多彩な細胞応答を制御する DNA 修復研究の最先端」（座長） (2016)
  • 著者名/発表者名: 柴田淳史
  • 学会等名: 日本放射線影響学会第59回大会
  • 発表場所: JMSアステールプラザ（広島県・広島市）
  • 年月日: 2016-10-26 – 2016-10-28
• [学会発表] DNA二本鎖切断修復経路を制御するDNA end resectionの多段階調節機 (2016)
  • 著者名/発表者名: 柴田淳史
  • 学会等名: 遺伝研研究集会「生物ゲノム安定維持の分子機構」
  • 発表場所: 国立遺伝学研究所(静岡県・三島市）
  • 年月日: 2016-10-24 – 2016-10-25
  • 招待講演
• [学会発表] BRCA1 directs the repair pathway to homologous recombination by promoting 53BP1 dephosphorylation (2016)
  • 著者名/発表者名: 柴田淳史
  • 学会等名: The 32th International Symposium “Growing Edge of Radiation Biology, from principles to applications”
  • 発表場所: ホテルコープイン京都(京都府・京都市)
  • 年月日: 2016-09-01 – 2016-09-02
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] BRCA1 directs the repair pathway to homologous recombination by promoting 53BP1 dephosphorylation. (2016)
  • 著者名/発表者名: 柴田淳史
  • 学会等名: Abcam Conference “Mechanisms of Recombination”
  • 発表場所: アリカンテ(スペイン)
  • 年月日: 2016-05-19 – 2016-05-23
  • 国際学会
• [備考] DNA修復研究 柴田研究室
  • URL: http://shibatalab.com/
• [備考] SHIBATA LAB
  • URL: http://shibatalab.com/english/