| 研究課題/領域番号 |
26670582
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
宮川 周士 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90273648)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | ブタ内在性レトロウイルス（PERVs） / CRISPR/CS システム / Off targeting 効果 / Gag-pol |
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| 研究実績の概要 |
今回我々は、遺伝子工学の発達により報告されたCRISPR/CSシステムでブタ内在性レトロウイルス(PERVs)を一挙にKnockout(KO)することを目的としている。
まず、報告されているPERVのsequenceを比較して、gagの重要部分を中心にCRISPH/CSのKO位置を計３８カ所選定した。次に、Off targeting効果が出ない様に、ブタgenomeのdata baseと十分比べあわせ、可能性の少ない部分を前半４カ所選び出し得たが、後半は０カ所であった。
つぎに、pol領域を調べた。同じく２０カ所選定し、Off targeting効果が出にくい部位を４カ所選んだ。
Gag-polのそれぞれの部位の前後約500bpをあらかじめpCAG-EGxxFP Vectorに組み込みこんだ。そして、これをタ－ゲットに使い、これと同時にそれぞれの設計箇所＝(G(N19)NGGを組み込んだpX330=U6-(G(N19)NGG)+CBh-NLS+hSpCas9+NLS+polyAを作製し、これらをHEK293T細胞(ヒト細胞)へ遺伝子導入した。結果、もっとも効率よくGag-polの部分の遺伝子を切り、GFPがよく光った箇所を、効率の良い箇所とし、gagで1カ所、polで1カ所選定で得た。加えて、この２カ所のOff targeting 効果は、両方ともN11、N12、N13とも11であった。
これと同時に、ヒト細胞のPREV感染の有無を検定するPCRの条件を設定し得た。また、PERV LacZ assayのためのPEC/LacZ(B)細胞、HEC293細胞を用意した
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
予定した計画では、なるべく早い時期にCRISPR/CS を設定し、続いてPERV assayシステムを立ち上げたうえで、ブタの細胞でCRISPR/CSを使ってPERVを潰すはずであった。
思いのほか、PERVに設定したCRISPRにOff targeting 効果が想定されたため、達成度としては現在十分ではない。
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| 今後の研究の推進方策 |
他のドイツの施設から、ZFN法を使って、同じくPERVにこれを設定し、knockoutを試みた報告がでたが、このグループはKOに失敗している。つまり、Off targeting効果が出過ぎたようである。
我々も根気よく、各target siteを検定していく予定である。
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