「細胞生存」と「細胞自体により制御される細胞死」に対するいくつかの光プローブのデザインと作製を前年度に引き続き行った。細胞生存に対する光プローブは、生存シグナルの中心的な細胞内分子Aktの活性化をモニターするための光プローブのデザイン・作製(昨年度終了)と細胞によるプローブ機能評価(当該年度施行)を行った。細胞自体により制御される細胞死に対する光プローブは、主としてアポトーシス、ネクロプトーシス(プログラムされたネクローシス)に焦点を絞り研究を進めた。 1 初年度に作製したAkt機能プローブに関しては、光プローブのリンカー部分の長さを調整するなどマイナーチェンジを行い、そのシグナル強度の改善を試みた。その後、それぞれ細胞レベルで再度評価実験を行ったところ、現時点では更なる改善が必要と判断された。 2 アポトーシスに対するプローブ(カスパーゼ3活性)に関しては、細胞実験による評価で、十分な感受性・特異性とシグナル強度を認めた。そのため、マウス実験に移行した。マウス肝に導入した光プローブにより、マウス肝傷害モデル、肝炎誘導モデル等によるカスパーゼ3活性(つまり、アポトーシスによる細胞死)と肝傷害との関係を解析した。その結果、マウス肝におけるアポトーシスの動的評価を行うとともに、その病態における意義を解析することが出来た。今後は種々の細胞死、または病態におけるアポトーシスの役割を検討する予定である。 3 ネクロプトーシス評価に対する光プローブをデザインし、作製した。RIP1/RIP3の二量体化に対するプローブを作製し、細胞内にて発現させることに成功した。現在細胞実験における評価を開始した。 4オートファジー死を評価するための光プローブ(p62/SQSTM1遺伝子のレポーター)を作製した。現在細胞への遺伝子導入実験を行っている。
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