| 研究課題/領域番号 |
26670624
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
加賀 基知三 北海道大学, 大学病院, 講師 (80224335)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 悪性胸膜中皮腫 / RNA編集 / 悪性化 |
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| 研究実績の概要 |
ヒト悪性胸膜中皮腫細胞がRNA編集をうけたCOPA遺伝子産物（小胞体・ゴルジ体間のタンパク質輸送に関わる被覆小胞複合体を構成するタンパク質のひとつ）を数％産生していることはすでに見出している。本プロジェクトでは、RNA編集型と未編集型のCOPA遺伝子産物の機能の違いを調べるために各発現ベクターを作製し、ヒト悪性胸膜中皮腫細胞に過剰発現させ腫瘍生物学的性状について検討した。その結果、いずれの型のCOPAを過剰発現させても悪性中皮腫細胞の増殖は親株に比べ、低下することがわかった。また、細胞運動能や浸潤能は、いずれのCOPAを過剰発現させても親株と同等であった。
一方、編集型COPAの発現を増加あるいは減少させる細胞ストレスの同定を試みた。悪性中皮腫細胞を低密度から高密度の異なる細胞密度で培養したところ、高密度で編集型COPAの産生が増加することが明らかとなった。その原因として、培地中の栄養分の枯渇、pHの低下などを考え、現在、低グルコース濃度、低グルタミン濃度、培地の酸性化、小胞体ストレスなどを細胞に負荷して編集型／未編集型COPAの産生比を解析している。悪性中皮腫細胞に強制的に編集型あるいは未編集型のCOPAを発現させてきたが，この実験系では内在性のCOPA産物が常に存在するため、編集型あるいは未編集型のいずれか一方だけのCOPAを発現・産生する細胞を得ることができないが，どちらか一方だけを発現させることができれば、両者間でみられる差がより明確になると考えられ，内在性のCOPA mRNAをsノックダウンするベクターを作成することとした．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
編集型および未編集型COPAを過剰発現させた複数のヒト悪性胸膜中皮腫細胞株を樹立し、それぞれの増殖，生存、運動、浸潤能などを解析することができた。現在のところ、編集型と未編集型COPAを過剰発現させた細胞の間で明確な腫瘍生物学的な性状の相違を見出すには至っていないが、ストレス存在下での細胞の形態等に両者間での違いが見出されるようになってきており、検討項目を絞りながらさらに解析を続けて行く。
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| 今後の研究の推進方策 |
いままでのところ、悪性中皮腫細胞に強制的に編集型あるいは未編集型のCOPAを発現させてきた。この実験系では内在性のCOPA産物が常に存在するため、編集型あるいは未編集型のいずれか一方だけのCOPAを発現・産生する細胞を得ることができない。どちらか一方だけを発現させることができれば、両者間でみられる差がより明確になると考えられる。そこで、今年度は内在性のCOPA mRNAをsiRNA（あるいはshRNA）（3’-UTRを標的とするように設計・作製）を用いてノックダウンし、その細胞にこれまで使用してきたCOPA発現ベクターを導入することによって、ほぼ100％編集型あるいは未編集型COPAを発現する細胞を樹立し、さらなる解析に用いる予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
編集型および未編集型COPAを過剰発現させた複数のヒト悪性胸膜中皮腫細胞株を樹立し、それぞれの増殖，生存、運動、浸潤能などを解析することができた。現在のところ、編集型と未編集型COPAを過剰発現させた細胞の間で明確な腫瘍生物学的な性状の相違を見出すには至っていない。このため，腫瘍生物学的な性状の相違から推測して遺伝子発現やタンパク発現，シグナル伝達に伴うタンパクリン酸化など，どのアッセイを優先的に行うか決定する段階に至っていない．このアッセイの保留が研究費費消の遅れの主因である．
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| 次年度使用額の使用計画 |
いままでのところ、悪性中皮腫細胞に強制的に編集型あるいは未編集型のCOPAを発現させてきた。この実験系では内在性のCOPA産物が常に存在するため、編集型あるいは未編集型のいずれか一方だけのCOPAを発現・産生する細胞を得ることができない。どちらか一方だけを発現させることができれば、両者間でみられる差がより明確になると考えられる。そこで、今年度は内在性のCOPA mRNAをsiRNA（あるいはshRNA）（3’-UTRを標的とするように設計・作製）を用いてノックダウンし、その細胞にこれまで使用してきたCOPA発現ベクターを導入することによって、ほぼ100％編集型あるいは未編集型COPAを発現する細胞を樹立し、さらなる解析に用いる予定である。腫瘍生物学的な性状の相違から遺伝子発現やタンパク発現，シグナル伝達に伴うタンパクリン酸化などのアッセイを行う予定である．
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